1 范围

本标准规定了蜂王浆中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-嗯唑烷酮(3-Amino-oxazolidin-2-one, AOZ)、呋喃它酮代谢物3-氨基-5-吗啉代甲基-2-嗯唑烷酮( 3-Amino-5-morpholinomethyl-oxazolidin-2-one,AMOZ)、呋喃西林代谢物氨基脲(semicarbazide, SEM)和呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-aminohy-dantoin, AHD)质谱/质谱测定方法。

本标准适用于蜂王浆中AOZ、AMOZ、SEM和AHD残留的定性确证和定量测定。

2 方法提要

样品经稀盐酸水解蛋白结合态中的硝基呋喃代谢物，用2-硝基苯甲醛(2-NBA)衍生化，三氯乙酸沉淀去除蛋白质，调pH值7.5后，清液过HLB小柱净化，分析物采用液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。

3 试剂和材料

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为超纯水。

3.1 甲醇：色谱纯。

3.2 乙腈：色谱纯。

3.3 乙酸乙酯：色谱纯。

3.4 邻硝基苯甲醛(2-NBA)。

3.5 二甲亚砜：色谱纯。

3.6 乙酸铵：色谱纯。

3.7 5 mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.19 g乙酸铵溶于适量水中，再定容到500 mL。

3.8 50％三氯乙酸：称50 g三氯乙酸，加50 g水溶解。

3.9 1 mol/L氢氧化钠溶液：称取40 g氢氧化钠，用水溶解定容至1 000 mL。

3.10 2-NBA衍生剂(50 mmol/L)：称取0.0378g邻硝基苯甲醛到烧杯中，加入5 mL二甲亚砜溶解，该溶液的浓度为50 mmol/L，现配。

3.11 0.1 mol/L磷酸氢二钾：称取8.71g无水磷酸氢二钾，加入500 mL水溶解。

3.12 0.2 mol/L盐酸溶液：量取17 mL浓盐酸用水定容至1 000 mL。

3.13 0.2％乙酸-乙腈(7+3，体积比):0.2％乙酸70 mL与30 mL乙腈混匀。

3.14 标准溶液配制

3.14.1 硝基呋喃类代谢物标准品：AOZ、SEM·HCI、AHD·HCI、AMOZ纯度均大于99％。

3.14.2 硝基呋喃类代谢物同位素标准品：AOZ-D₄纯度大于98％，SCA-¹⁵ Na₂-¹³C·HCI纯度大于99％,AHD-¹³C₃纯度大于98％,AMOZ-D。纯度大于98％。

3.14.3 标准储备液：分别称取适量AOZ、AMOZ、SEM·HC和AHD·HCI硝基呋喃代谢物标准，用甲醇溶解并定容1.0 mg/mL, 0℃～4℃保存，有效期6个月。

3.14.4 混合标准溶液：分别准确移取适量1.0mg/mL AOZ、SEM、AHD、AMOZ标准储备液(3.16)，用甲醇稀释定容至10 ng/mL、0℃～4℃保存，有效期7d。

3.14.5 同位素内标储备液：分别称取适量AOZ-D₄、AHD-¹³C₃、AMOZ-D₅和SCA-¹⁵ N₂-¹³C·HCI硝基呋喃代谢物同位素标准品，用甲醇溶解并定容到25 mL棕色容量瓶中，该溶液浓度为1.0mg/mL，0℃～4℃保存。

3.14.6 混合同位素内标溶液：分别准确移取适量1 mg/mL AOZ-D₄, SCA-¹⁵ N₂-¹³C、AHD-¹³C₃、AMOZ-D₅储备液(3.14.3)，用甲醇稀释定容为10 ng/mL, 0℃～4℃保存。

3.14.7 混合标准工作溶液：分别取混合标准溶液(3.14.4) 0 uL、60 uL、100 uL、200 uL、400uL，1000uL。加入混合同位素内标溶液(3.14.6) 200 uL, 3 mL, 0.2 mol/L稀盐酸和100uL 2-NBA衍生剂，混匀后37℃放置过夜。用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 7.5±0.2,5 mL乙酸乙酯液液萃取，将有机相在40℃氮吹至干后，用1.0 mL 0.2％乙酸-乙腈(7+3，体积比)(3.13)溶解残渣，该混合标准工作溶液相当于样品中含有 0 ug/kg, 0.3 ug/kg, 0.5 ug/kg, 1.0 ug/kg, 2.0 ug/kg, 5.0 ug/kg的硝基呋喃代谢物残留。

3.15 HLB小柱：OASIS HLB小柱，60mg，3mL或相当者。使用前用5 mL甲醇和5 mL水预淋洗。

4 仪器和设备

4.1 液相色谱-质谱/质谱联用仪：配有电喷雾源(ESI)。

4.2 旋转浓缩器。

4.3 混匀器。

4.4 真空固相萃取装置。

4.5 pH计：测量精度±0.02。

4.6 浓缩瓶：100 mL。

4.7 具盖塑料离心管：50 mL。

4.8 离心机：4000r/min。

4.9 烘箱。

5 试样制备与保存

取500 g代表性蜂王浆样品，在室温下解冻，等样品全部融化后搅匀，将试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在-18℃保存。

在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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