4.5 测定步骤

4.5.1 样液提取

4.5.1.1 牛奶：取20 mL鲜奶于50 ml、离心管，3000r/min离心5 min，除去上层脂肪层，以1.0 mol/L盐酸溶液或1.0 mol/L氢氧化钠调节pH至6.5～7.0。脱脂奶可直接用于检测。

4.5.1.2 肉类、鱼和虾：称取10.0g均质好的试样于50 mL离心管中，加入磷酸盐-丙酮缓冲液10 mL，用涡旋振荡器充分振荡3 min，于80℃水浴保温30 min后，3000r/min离心15 min取上清液作为样液。

4.5.2 菌悬液的制备

嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC10149菌悬液：一般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，55℃±1℃培养72 h镜检芽孢数达80％以上(如果达不到，可再培养数日，芽孢数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用)，用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，80℃水浴加热30 min，经3000 r/min离心20 min，弃去上清液，如此重复洗涤芽孢两次。然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行计数以确定菌种的浓度。置2℃～8℃冰箱保存，贮存期30d。

4.5.3 检定用平板的制备

将试验菌悬液按一定的比例加入到融化后冷却至60℃左右的灭菌检定培养基中充分混匀后，使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×10⁶ CFU/mL。在灭菌平皿中加入6 mL混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定用平板两个，分别放置两个滤纸片，加入约90 uL(以纸片吸满为准)0.005 ug/mL苄青霉素标准工作液，冷藏放置30 min后，63℃±1℃培养3.5 h能产生14 mm以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格，达不到要求的平板应弃去。制备好的平板置2℃～8℃冰箱可保存2d～3d。

4.5.4 测定

取制备好的检定用平板两个，在平板底部作好标记，将滤纸片适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，在其中一个滤纸片加入约90uL(以纸片吸满为准)0.005 ug/mL苄青霉素标准工作液作为阳性对照，其余的滤纸片中加入约90 uL样液，冷藏放置30 min后，63℃±1℃培养3.5h后开始观察，如果0.005 ug/mL苄青霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且大于14 mm时终止培养，记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做两个平板上的平行试验。

4.6 检测结果判断和报告

4.6.1 如果样液在平板上无抑菌圈，0.005 ug/mL苄青霉素标准工作液的抑菌圈直径大于14 mm，即报告“阴性”。

4.6.2 如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在13 mm以上，即报告“初筛阳性”。

4.6.3 如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于13 mm，大于10 mm，或者两个平行结果不一致时，视为可疑，应重新测试后判定。

4.6.4 阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。

5 检测限

本标准的检测限见表1。

表1 β-内酰胺类药物检测限

相关链接：进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测方法（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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