(一)原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下发出荧光。没有其他物质干扰时，此荧光相对强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应用经过离子交换剂使硫胺素与杂质分离岳的溶液测定。

(二)仪器与主要试剂

荧光分光光度计；电热恒温培养箱；Maizel—Gerson反应瓶如图9～1所示；淀粉酶和蛋白酶；0．1mol／L，0．3mol／L盐酸；2mol／L乙酸钠溶液；氯化钾溶液(250g／L)；酸性氯化钾溶液(250g／L)(8．5mL浓盐酸用25％氯化钾溶液稀释至1000mL)；1％铁氰化钾溶液(10g／L)(1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL，放于棕色瓶内保存)；碱性铁氰化钾溶液(取4mL 10g／L铁氰化钾溶液，用150g／L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用)。

活性人造浮石：称200g 40～60目人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗两次，每次10min；再用5倍于其容积的250g／L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子，于蒸馏水中保存。

硫胺素标准储备溶液(0．1g／mL)：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.0lmol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存。用时用0.01mol／L盐酸逐级稀释为0.1μg／mL的硫胺素标准使用液。

溴甲酚绿溶液(0．4g／L)：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

(三)测定

试样采集后用匀浆机打成匀浆于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。

准确称取一定量试样(估计其硫胺素质量约为10～30μg，一般称取2～10g试样)，置于l00mL三角瓶中，加入50mL0.1mol／L或0.3mol／L盐酸使其溶解，放人高压锅中加热水解，121℃30rain，凉后取出。用2mol／L乙酸钠调pH 4．5(以0.4g／L溴甲酚绿为外指示剂)。按每克试样加20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶，于45～50℃温箱过夜保温(约16h)，凉至室温，定容至100mL后混匀过滤，即为提取液。

用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1／3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。用移液管加入提取液20～60mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总质量约为2～5μg)。加约10mL热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复3次。加入20mL 250g／L酸性氯化钾(温度为90℃左右)，收集此液于25mL刻度试管内，凉至室温，用250g／L酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。

重复上述操作，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替试样提取液，即得到标准净化液。将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。在避光条件下将3mL150g／L氢氧化钠加入反应瓶A，将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇1．5min。重复上述操作，用标准净化液代替试样净化液。静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2～3g无水硫酸钠使溶液脱水。

荧光测定条件：激发波长365nm，发射波长435nm；激发波狭缝5nm，发射波狭缝5nm。

依次测定下列荧光强度：①试样空白荧光强度(试样反应瓶A)；②标准空白荧光强度(标准反应瓶A)：③试样荧光强度(试样反应瓶B)；④标准荧光强度(标准反应瓶B)。