3.1.4残留分析技术

3.1.4.1 前处理方法

目前，AGs残留检测涉及的主要基质有蜂蜜、牛奶，以及肝脏、肾脏、肌肉等动物组织。这些基质往往含有较多蛋白质和氨基酸，使AGs易与蛋白质和脂类等混杂在一起，导致色谱柱污染。样品的预处理是为了除去混杂物以免污染色谱柱和干扰AGs的分离分析。样品前处理主要包括提取、净化和浓缩等步骤。

(1)提取方法

生物样品中AGs难以用非极性有机溶剂提取，常用水溶液和极性溶剂提取，采用的提取方法主要有液液萃取法(LLE)、加速溶剂萃取法(ASE)和基质固相分散法(MSPD)等。

1)液液萃取(liquid liquid extraction, LLE)

AGs具有水溶性，可以用乙腈、水等极性溶剂直接提取。同时，在提取时还可加入三氟乙酸、三氯乙酸、高氯酸等溶液沉淀蛋白质，将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。

Kowalski等用毛细管电泳法(CE)检测蛋黄中的链霉素，采用乙腈作提取溶剂，同时沉淀蛋白质，回收率可达71.8%。Kumar等建立了检测动物肾脏和蜂蜜中10种AGs的测定方法。肾脏用水溶液提取,蜂蜜用水溶解,经弱阳离子交换柱固相萃取净化后,液相色谱-三重四极杆质谱(LC-MS/MS)检测。蜂蜜和肾脏中的定量限(LOQ)分别为2～125ug/kg和25～264ug/kg,日间相对标准偏差(RSD)分别为6%～26%和2%～21%。Tao等应用LC-MS/MS建立了同时测定肌肉、肝脏(猪、鸡和牛)、肾脏(猪和牛)、牛奶和鸡蛋中15种AGs的全自动分析方法。匀浆后的样品用磷酸二氢钾缓冲液(含乙二胺四乙酸)萃取，用羧酸柱进行自动固相萃取净化，LC-MS/MS测定。10种AGs的检测限(CCa)和检测能力(CCβ)值范围分别为8.1～11.8ug/kg和16.4～21.8ug/kg；方法回收率范围为71%～108%。

Vinas等在检测蜂蜜、牛奶、鸡蛋和肝脏中链霉素和双氢链霉素时，用0.5 mol/L高氯酸溶液水解，释放蛋白结合态的分析物，并沉淀蛋白质，上清液用饱和氢氧化钠溶液调至中性后，进高效液相色谱(HPLC)检测，回收率良好，链霉素的检出限(LOD)为7.5μg/kg，双氢链霉素为15ug/kg。Almeida等建立了测定家禽、猪、马和牛肾脏中10种AGs残留的分析方法。使用含有三氟乙酸的磷酸盐缓冲液提取后，进行中和，再用阳离子交换柱净化，LC-MS/MS测定。方法CCa和CCβ分别为1036～12293ug/kg和1073～14588ug/kg；LOQ为27～688ugkg；家禽肾脏中所有待测物的回收率大于90%，RSD小于15%。孙雷等采用10mmol/L KH₂PO₄溶液(含0.4mmol/L EDTA和2%三氯乙酸)涡旋振荡提取动物组织中的8种AGs，调节pH7.5～8.0后，再用CBX固相萃取柱净化，UPLC-MS/MS测定。8种AGs的LOD为5ug/kg；LOQ为10ug/kg；方法平均回收率为83.0%～114.1%，批内RSD为1.1%～11.4%，批间RSD为2.1%～8.9%。

2)加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction,ASE)

加速溶剂萃取是在提高的温度(50～200℃)和压力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖样品前处理方法。

Ding等报道了定量测定生物样品中林可霉素的分析方法。样品先冻干，碾磨成粉，再用ASE提取。实验发现，用乙腈-水(7+3，v/v)在100℃、100bar提取15min，循环3次，效果最佳。再经固相萃取柱净化后，LC-MS/MS测定，方法回收率在77%～88%之间。Yuan等开发采用ASE提取动物源食品中林可霉素和大观霉素等残留分析方法。采用磷酸盐缓冲液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，再用C₁₈固相萃取柱净化，经衍生化后，用气相色谱(GC)和气相色谱-质谱(GC-MS)测定。作者对ASE的压力、温度、循环次数等参数进行了优化。林可霉素和大观霉素GC方法的LOQ分别为16.4μg/kg和21.4μg/kg，GC-MS分别为4.1ug/kg和5.6ug/kg；在20～200ug/kg添加范围，GC方法的回收率为73%～99%， RSD小于17%；在5～20ug/kg添加范围，GC-MS的回收率为70%～93%,RSD小于21%。

3)基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion, MSPD)

MSPD是将样品直接与合适的固相填料一起混合、研磨，使样品均匀分散于固体相颗粒表面，基于固相填料与样品中的目标化合物产生各种作用力，将目标物与样品基质分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。MSPD可有效避免在前处理中目标化合物的损失，提高检测限。

Bogialli等10利用EDTA冲洗过的海沙作为固相填料，与牛奶混合装柱，采用MSPD法提取牛奶中的9种AGs。用70℃热水洗脱，调至pH4.1，过滤后进LC-MS/MS检测。该方法外标法定量的回收率在70%～92%之间，内标法定量的回收率在80%～107%之间，RSD小于11%；LOQ在2～13ug/L之间。罗瑞峰等川将猪肉与酸性氧化铝混合碾磨，采用MSPD法提取残留的链霉素。再经C₁₈固相萃取柱净化后，用HPLC-柱后衍生化检测。该方法线性范围为10～200ug/kg，回收率77.4%～86.5%，RSD为2.0%～3.53%，检测限为5ug/kg。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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