一、双指示剂甲醛滴定法

氨基酸含有酸性的COOH基，也含有碱性的一NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的钠盐，不能直接用碱液滴定它的梭基。当加入甲醛时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，使COOH基显示出酸性，可用氢氧化钠标准溶液滴定。

用此法滴定的结果表示a一氨基酸态氮的含量，其精确度仅达氨基酸理论含量的90%。如果样品中只含有某一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据，但一般常用此法测定蛋白质水解程度，当水解完成后，滴定值不再增加。但应注意，脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羟基，滴定时要消耗一些碱，使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，使结果偏高。

样品中氨基酸含量根据下列公式计算：

X＝[(V2一V1)×C×0.014]/V×100

式中：X—氨基酸含量，g/100mL;

V1—中性红作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL;

V2—百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL;

C—氢氧化钠标准液的浓度，mol/L;

V—样品液取用量，mL;

0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol。

说明及注意事项如下。

(1)此法适用于测定食品中的游离氨基酸。

(2）固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。

(3)若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。

(4）与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和COOH基时的pH值为8.5一9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。

二、电位滴定法

本法根据酸度计指示pH值控制滴定终点，适合有色样液的检测。

样品中氨基酸含量根据下列公式计算：

X＝[(V1一V2)×C×0.014]/（5×V）×100

式中：X—氨基酸含量，g/100mL;

V1—测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液，mL;

V2—试剂空白试验加如甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;

C—氢氧化钠标准液的浓度，moVL;

V—样品稀释液取用量，mL;

0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol。

说明及注意事项如下。

(1)本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。

(2）对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。

三、茚三酮比色法

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。

样品中氨基酸含量根据下列公式计算：

X=c/(m×1000)×100

式中：X—氨基酸含量，μg/l00g;

c—从标准曲线上查得的氨基酸的含量，μg;

m—测定的样品溶液相当于样品的质量，g。

说明及注意事项如下。

茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化。方法为：取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1min，静置30min，过滤；将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。

四、氨基酸自动分析仪法

食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。

测定在氨基酸自动分析仪上完成，可控制的操作条件包括缓冲液流量、茚三酮流量、柱温、色谱柱规格。

上机样品液中氨基酸总量根据下列公式计算：

N=（c×A1）/A0

式中：N—上机样品液中氨基酸量，nmol/50μL;

c—上机标准液中氨基酸量，nmol/50μL;

A1—样品峰面积；

A0—氨基酸标准峰面积。

样品中氨基酸含量根据下列公式计算：

X=(N×f×Mr×100)/(m×V×106)

式中：N—上机样品液中氨基酸量，mg/100g;

f—样品的稀释倍数；

Mr—氨基酸的相对分子质量；

m—样品的质量，g;

V—上机时的进样量（此处为50μL)。

说明及注意事项如下。

(1)样品中氨基酸的含量在1.00g/100g以下，保留两位有效数字；含量在1.00g/100g以上，保留三位有效数字。

(2)16种氨基酸相对分子质量；天冬氨酸133.1;苏氨酸119.1;丝氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；纈氨酸117.2；蛋氨酸149.2;异亮氨酸131.2；亮氨酸131.2；酪氨酸181.2；苯丙氨酸165.2;组氨酸155.2；赖氨酸146.2；精氨酸174.2。

(3）标准出峰顺序和保留时间见表，标准图谱如图。

(4)本法为国家标准食物中氨基酸的测定方法，适用于食物中的16种氨基酸的测定，最低检出限为10pmol。但本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。