一、实训目标

1．学会吸收曲线、标准曲线的绘制和选择波长的方法；

2．掌握721型等分光光度计的使用方法；

3．学会应用标准曲线法进行定量分析。

二、实训原理

邻菲罗啉（又称邻二氮菲）是测定微量铁的一种较好的显色剂。在pH为2-9的条件下，Fe2＋与邻菲罗啉生成极稳定的橘红色配合物（1gK稳=21.3)，反应式如下：

当Fe以Fe3＋形式存在于溶液中时，Fe3＋与邻菲罗啉也生成配位比为1：3的淡蓝色配合物，但稳定性较差，其1gK稳=14.1。故在显色前首先用还原剂（盐酸胺）将其还原为Fe2+，其反应式如下：

4Fe³⁺+2NH₂OH→4Fe²⁺+N₂O+H₂O+4H⁺

羟胺

测定时，一般控制溶液酸度为pH为4-6。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则Fe2+水解，影响显色。邻菲罗琳铁的最大吸收波长为510nm。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

721型分光光度计；自动加液器；容量瓶；吸量管；移液管。

2．试剂

100μg/mL铁标准溶液；10.0μg/mL铁标准使用液；lg/L邻菲罗啉水溶液；100g/L盐酸羟胺水溶液（临用时配制）；HAc-NaAc缓冲溶液（pH=4.5)。

四、实训步骤

1．标准系列的配制

分别吸取Fe^3＋标准使用液0mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL、10.00mL于已经编号1-10的10只50mL容量瓶中，加盐酸羟胺溶液1mL，摇匀，稍停；再分别加入HAc-NaAc缓冲溶液10mL、邻菲罗啉溶液5mL，每加一种试剂后均摇匀再加另一种试剂，最后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15min。

2．邻菲罗啉铁吸收曲线的绘制
取上述5号瓶中的试液，用2cm吸收池，以1号试液作参比，在分光光度计中于波长440-600nm分别测定其吸光度A，并将结果填入下表。

以波长为横坐标、相应的吸光度A为纵坐标绘制邻菲罗琳铁的吸收曲线，求出最大吸光度值所对应的波长值。

3．标准曲线的绘制

用分光光度计在其最大吸收峰的波长（510nm）处，分别测定上述标准系列溶液的吸光度。用2cm吸收池，以不加铁的试剂溶液(1号）作参比。

以ρ/(μg/mL）为横坐标、相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4．试样中铁含量的测定

吸取水样25.00mL于50mL容量瓶中，按绘制标准曲线的操作，加入各种试剂显色，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂溶液（(1号）作参比，于分光光度计上测得吸光度Ax。由标准曲线求出相应的Fe含量ρx(μg/mL)。

5．结果计算

试样中的含铁量（μg/L)可由下式计算：

ρ(Fe）=ρx×50.00/V×1000

式中ρx——由试样的吸光度在标准曲线上求出的相应Fe含量，μg/mL;

V——吸取试样的体积，mL。

五、注意事项

(1)在显色前首先用还原剂（盐酸羟胺）将Fe^3＋其还原为Fe²⁺。

(2）测定时，一般控制溶液酸度为pH为4-6。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则Fe2+水解，影响显色。

(3)如果吸收池有误差，可在两吸收池中装入空白试液，测出吸收池的误差值，在测定样品时减去吸收池的误差。

(4)试样和标准曲线测定的实验条件应尽可能保持一致，最好两者同时显色同时测定。试样的吸光度要在标准曲线的线性部分，可适当调节标准系列溶液的加入量或试样的体积以满足此要求。

(5)盐酸羟胺易氧化，不宜久置，最好现用现配制；本实验要注意试剂的加入顺序不能颠倒。