黄芩苷具有清除氧自由基、减轻组织缺血再灌注损伤、促进细胞凋亡以及抗肿瘤等多方面的作用［3］。黄芩苷具有多种药理活性，在中药中的应用非常广泛，用量也特别的大，但相关报道其生物利用度较低［4］。因此，在传统种植、提取及含量测定研究的同时，建立黄芩苷的血药浓度测定方法，研究其体内代谢过程，具有十分重要的基础和临床意义。2007年4月对兔血浆中黄芩苷的含量测定方法进行了研究，并测定了灌胃后家兔体内黄芩苷浓度，同时对其进行了相应的药代动力学分析。

1仪器与试药

   Agilent1100系列高效液相色谱仪（四元泵、可变波长检测器、自动进样器、柱温箱、化学工作站B.01.01C版），TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；黄芩提取物（含黄芩苷90%，四川省玉鑫药业有限公司），黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所,批号110715-200514）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。实验用兔由贵阳医学院动物中心提供。

2方法与结果

• 2.1色谱条件：色谱柱:Diamosil-C18（250mm×4.6mm,5μm），Phenomenex-C18保护柱（3mm×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈-0.1％磷酸（25∶75，V/V）；流速:1ml/min；检测波长：275nm；柱温:40℃;进样量:50μl。
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• 2.2血浆样本处理：取待测血浆0.2ml,加入PEG4000.2ml,2%的偏磷酸0.2ml，涡旋混合30s沉淀蛋白,高速离心（16000r/min）10min,取上清液50μl进样测定。
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• 2.3检测：限在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作，得黄芩苷的最低检测浓度0.02908mg/L（S/N≥3）。
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• 2.4方法专一性：在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作,比较空白血浆，空白血浆加黄芩苷对照品、血浆样品,考察方法的专一性。结果见图1。
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• 2.5标准曲线的绘制：精密吸取空白血浆0.2ml，分别加入标准系列的黄芩苷对照品溶液，按血浆样品的处理方法操作，制成相当于黄芩苷浓度为0.08722mg/L、0.1454mg/L、0.2908mg/L、0.5815mg/L、1.163mg/L、2.9075mg/L的血浆溶液，进样50μl测定。将黄芩苷峰面积（A）对浓度（C）进行回归，得直线回归方程为：A=60.95237×C＋3.98252，r=0.9989。由此可表明该方法在0.087～2.900mg/L浓度线性关系良好。
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• 2.6回收率试验：取空白血浆200μl,按“标准曲线”条件项下方法配成低、中、高3个质量浓度（分别为0.08722mg/L、0.2908mg/L、2.908mg/L）的QC样品各3份,按样品处理方法处理后进行测定,同时配制相同浓度的黄芩苷标准溶液进行测定。与血浆样品结果对比，得到低、中、高3个浓度的QC样品的相对回收率，分别为96.3％、97.3％和96.6％。
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• 2.7精密度试验：日内精密度：配制含黄芩苷浓度为0.08722、0.2908和2.908mg/L的QC样品各3份，在同一天内进行样品的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为2.37%、1.04%和0.92%。日间精密度：按上法配制QC样品各3份，在3d中进行相同的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为5.86％、3.92％和2.58％。
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• 2.8稳定性试验：上述样品于回收率试验后，放置于4℃冰箱，10d后复测，色谱峰面积变化不大，可见血浆样品10d内在4℃条件下稳定。
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• 2.9血药浓度测定：健康家兔3只,经灌胃予黄芩提取物90mg/kg，给药后0.083、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0h定时静脉取血0.5ml。分离血浆,取0.2ml血浆按“血浆样品处理”条下操作,测定黄芩苷含量。实验数据采用3P87药代动力学方程进行曲线拟合,权重因子为1/C2（C为血药浓度）,所得药代动力学参数见表1。表1黄芩苷的主要药代动力学参数（略）注：C为血药浓度，AUC为血药浓度曲线下面积

3讨论

• 3.1流动相溶剂的选择：在0.4%磷酸-甲醇系统中，空白血浆的背景影响大于0.1%磷酸-乙腈的系统影响。同时以0.4%磷酸和0.1%磷酸对黄芩苷峰型的影响无明显区别，而0.1%磷酸-乙腈系统的pH值在5左右，0.4%磷酸-乙腈pH值在3左右，用0.1%磷酸-乙腈系统更有益于色谱柱的保护，因此，选用0.1%磷酸-乙腈系统做为生物样品中黄芩苷分析的洗脱系统［5］。
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• 3.2兔血浆中蛋白质的处理：考虑到样品处理的简便、快速，首先选用蛋白质沉淀法，选取过甲醇、乙腈、丙酮、中性盐和加热沉淀法，均不能满足实验要求［6，7］。偏磷酸是一种酸性沉淀剂，其作用机制是使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀。实验选取1%、2%、5%的偏磷酸做为蛋白质沉淀剂，比较后发现用偏磷酸沉淀蛋白，黄芩苷的峰型很好，理论塔板数较高，但样品的绝对回收率很低，且随着偏磷酸的浓度增高，绝对回收率逐渐降低。通过先加入PEG400再加入偏磷酸沉淀蛋白质的方法可改善黄芩苷的回收率，使其符合要求。

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