在正确制备培养基的基础上，能正确运用平板接种法正确进行细菌总数的测定；掌握饮用水、水源水的细菌总数测定方法、步骤和要点。

一、营养琼脂培养基(供细菌总数的测定)

称取：蛋白陈2.5g，牛肉膏0.75g, NaCl1.25g于500ml烧杯中，加150ml蒸馏水溶解，另称取琼脂5g加100ml蒸馏水溶解，待全部溶解后，混匀，加10％ NaOH，调pH =7.4～7.6，熟化1h，除垢，用棉花过滤，分装，在121℃条件下，灭菌20min，备用。

二、仪器

1．高压蒸汽灭菌器。

2．干热灭菌(烘箱)。

3．水浴隔热培养箱。

4．冰箱。

5.培养皿(直径9ml)。

6．吸管(10.0ml、1.0m1)。

三、菌落计数原则

1．一个平皿有较大片菌落生长时，不宜采用；

2．无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数；

3．成片状菌落不到平皿的一半，其余一半的菌落数分布均匀，则将半皿计数×2报告之。

四、注意事项

1．检验中所用玻璃器皿应洗净后采用干热灭菌法(160℃，2h)进行灭菌；

2．培养基的pH值调节要正确；

3．培养基配制和储存是以2周为限；

4．培养基不宜反复多次灭菌，防止pH值下降；

5．灭菌间隔时间一般不超过4h;

6．培养基如发现产气、混浊、有菌膜、变色、有菌落、沉淀等应废弃；

7．平皿菌落计数时，肉眼观察，必要时可用放大镜，以防遗漏，计下各平皿的菌落。

[任务实施]

一、生活饮用水

1．取三个培养皿，分别是一个空白、另两个加1.0ml水样；

2．浇营养琼脂培养基(冷却至45℃～50℃，无菌操作)2～3 mm，冷却至室温、凝固后倒置；

3．在37℃，培养24小时后，观察结果并记录。

二、水源水

1．用无菌水稀释水样分别为0.1、0.01、0.001 ml的稀释比；

2．取四个培养皿，分别是空白、0.1、0.01、0.001ml的稀释比的水样加1.0ml水样；

3．浇营养琼脂培养基(冷却至45～50℃，无菌操作)2～3mm，冷却至室温、凝固后倒置；

4．在37℃，培养24h后，观察结果并记录。

［知识链接]

一、测定细菌总数的意义

在37℃营养琼脂培养基中能生长的细菌代表在人体温度下能繁殖的腐生细菌，细菌总数愈大，说明水污染也愈严重，因此这项测定有一定卫生学意义；当水被人畜粪便及其污染物污染时，细菌就会大量繁殖，细菌总数急剧增加，说明水中有大量有机腐败产物，从而推测有致病菌污染的可能，但不能据此判断水被粪便污染；水中细菌总数可用来判断水质的清洁程度，卫生学意义不如大肠菌群，含有少量的致病菌的水比含有大量的腐生菌的水更可怕；对于检查自来水厂中各个处理设备的处理效率，细菌总数的测定则有一定的实用意义，因为如果设备的运转稍有失误，立刻就会影响到水中细菌的数量。

细菌总数按定义表示能适应特定的培养条件而生长的总细菌菌落数量，而不是水中所有的细菌数；37℃的确定主要是致病菌的最适生长温度为37℃，又是人体体温，这种条件下检出的细菌都可在人体内繁殖和致病；细菌总数的评价有局限性，但具有相对性，尤其对水处理的效果方面有一定的作用。

二、细菌总数的测定

l.概述：将1 ml被检水样接种于营养琼脂培养基中，在37℃温度下培养24h后，数出生长的细菌菌落数，然后根据接种的水样数量及稀释比即可算出每毫升水中所含的细菌总数。

2．细菌菌落总数的计数方法（表14-2)

菌落总数的计算方法举例

说明：菌落数100以内按实际数报告，大于100时，采用2位有效数报告，在2位有效数字后面的数值，应四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，可以采用10的指数倍来表示，未经稀释的水样，按培养皿中实际生长的菌落数报告，若无法计数，应报告稀释倍数。

(1)首先选择平均菌落在30～300之间者进行计算，当只有一个符合此范围，则以该平均菌落×稀释倍数报告之；

(2)若两个稀释度，其平均菌落都在30～300之间者，则应按两者菌落总数之比值来决定：小于2应以两者的平均菌落数×稀释倍数报告之，大于2应以其中较小的菌落总数×稀释倍数报告之；

(3)若所有稀释度的平均菌落都大于300，则以稀释度最高的平均菌落数×稀释倍数报告之；

(4)若所有稀释度的平均菌落都大于30，则以稀释度最低的平均菌落数×稀释倍数报告之；

(5)若所有稀释度的平均菌落都不在30～300之间者，则以最接近30或300的平均菌落数×稀释倍数报告之。

三、培养基的制备、分装、灭菌

1．配制培养基的原则

(1)适合微生物的营养特点；

任何培养基都必须含有碳源，氮源，矿质元素，水及生长因素，但不同营养类型的微生物要求不同，自养菌的培养基不能含有有机物，异养菌则以有机物为碳源和能源。

(2)注意各种营养物质的浓度与配比；

微生物生长所需要的营养往往在浓度合适的条件下表现出良好的作用，浓度太大反而对微生物生长起抑止作用。

(3)控制培养基的pH值。

满足不同类型微生物的生长繁殖或积累代谢物的需要。

如：霉菌和酵母菌pH=4.5～6.0

细菌、放线菌pH=7.0～7.5

2．配制培养基的基本过程(简要步骤和要点)

(1)配制溶液：分别溶解、加热。

(2)调节pH值：10％HCI、10％NaOH、pH试纸。

(3)熟化、澄清、过滤(棉花过滤)。

(4)分装：1/3～2/3棉塞。

(5)灭菌含糖10磅15min，不含糖15磅20min。

(6)斜面培养基的制作。

(7)平面培养基的制作。

(8)培养基保存：分装后4小时内进行灭菌，在冰箱中(4℃)保存一周；能溶解足够氧而产生气泡(特别是发酵)，必须赶走气泡(37℃状态)，如还有气泡应弃掉。

四、高温灭菌的原理和方法

(一)高温灭菌的原理

微生物对高温十分敏感，高温灭菌是微生物实验、食品加工及发酵工业重要灭菌方法，菌体在有水的情况下，蛋白质易凝固，含水量越高，蛋白质凝固所需要的温度就越低。热蒸汽穿透力大，蒸汽有潜热存在，当蒸汽在物质表面凝结为水时，要放出潜热，从而提高了灭菌物品的反应，蒸汽温度随压力的增加而提高，压力越大，温度越高，蒸汽在高压条件下，能够形成强大穿透力，使细胞中原生质在含水率高时，受热易凝固变形而致死。

(二)高温灭菌的方法

主要有干热灭菌、湿热灭菌，湿热灭菌较干热灭菌效果好。

1．干热灭菌法：

(1)干热灭菌(适合玻璃仪器，金属仪器)：160℃，干燥箱1～2h。

(2)焚烧灭菌：在火焰中直接灭菌，灭菌彻底迅速，用于接种工具，污染物品，实验动物废弃物。

2．湿热灭菌法：

(1)煮沸灭菌：物品在水中煮沸(100℃), 15分钟以上，可杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢，如延长煮沸时间，在水中放1％Na₂C₃或2％～5％石炭酸，效果更好，用于注射器、解剖用具的消毒。

(2)高压蒸汽灭菌：(用于培养基、抽滤筒、生理盐水、玻璃皿、工作服等的消毒)工作压力有15磅，10磅不等。灭菌所需的时间和温度取决于被灭菌物品的性质、体积与容器类型等，它是湿热灭菌法中效果最好，应用较广。

(3)间歇灭菌：常压下100℃，15～30min，杀死其中的营养细胞→冷却→28～37℃。保温24h使残存的芽孢萌发成细胞；如此反复三次，可杀死所有芽孢和物质，达到灭菌的目的。缺点：较费时，只用于不耐热的药品、营养物和特殊培养基。

(4)巴斯德灭菌：60～70℃, 25～30min，可去除食品(牛奶、酒)中的病原微生物，同时保持食品中的营养、新鲜的风味。

相关链接：福尔马肼标准溶液的配制