一、实训目标

1．掌握HPLC法测定原料药中有关物质的原理与限量计算方法；

2．掌握TLC法测定原料药中有关物质的原理与测定方法；

3．熟悉高效液相色谱仪的工作原理和操作方法；

4.熟悉黏合薄层板的制备与活化；

5．了解高效液相色谱仪的主要部件和日常维护。

二、实训原理

HPLC法，指高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC),其特点填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（HighPressureLiquidChrmatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法（HighSpeedLiquidChrmatography,HSLC)。也称现代液相色谱。

TLC法，指的是薄层色谱（ThinLayerChromatography)，又称薄层层析，属于固一液吸附色谱。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.0lμg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。此法在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步变化来判断反应是否完成。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

高效液相色谱仪；ODS柱；展开槽；玻板；喷雾器；点样用微量注射器或微量吸管。

2．试剂

硅胶H；硅胶GF254；对二甲氨基苯甲醛；对氨基苯甲酸；盐酸普鲁卡因注射液；马来酸氯苯那敏及氧氟沙星原料药。

四、实训步骤

（一）盐酸普鲁卡因（ProcaineHydrochloride）注射液中对氨基苯甲酸检查精密量取样品，加乙醇制成每1mL中含盐酸普鲁卡因2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每1mL中含30μg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各l0μL，分别点于含有羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（(14:1:1:4)为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液（(2％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液l00mL，加冰醋酸5mL制成）喷雾显色。供试品溶液如显示与对照品溶液相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深。

（二）马来酸氯苯那敏的（ChlorphenamineMaleate）有关物质检查

取样品，加氯仿制成每1mL中含50mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿稀释成每1mL中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙醋一甲醇一稀醋酸（5：3：2)为展开剂，展开后，晾干，在紫外光灯（254nm）下检视。供试品溶液除显氯苯那敏与马来酸两个斑点外，如显其他杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。

（三）氧氟沙星的（Ofloxacin）有关物质检查

1．色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L枸橼酸溶液-乙腈(79：21)，用三乙胺调节pH至4.0为流动相；流速约为1.2mL/min；检测波长为293nm。理论板数按氧氟沙星峰计算应不低于2500。

2．测定方法

取样品，加流动相制成每1mL中含lmg的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加流动相稀释成每1mL中含0.05mg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%；再取供试品溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图上各杂质峰面积的和不得大于对照溶液色谱图主峰面积的1/5。

五、注意事项

(1)薄层色谱分析中为使斑点集中，点样应分次点加，每次点加后，等其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。

(2）薄层板放入展开槽时，薄板底边应水平浸入展开剂中，待展开至溶剂前沿距玻板顶端2-3cm时，取出薄层板。

(3)展开缸必须密封，为使缸内展开剂饱和，薄层板放入前可在展开槽内壁贴滤纸条，让滤纸条一端浸入展开剂中，密封展开槽，待系统平衡后再将薄层板放入，展开。