一、实训目标

1．熟悉高效液相色谱仪的工作原理和操作方法；

2．掌握HPLC外标法测定药物含量的计算方法。

二、实训原理

头孢克洛（Cefaclor)

样品为（6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基]3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2..0]辛-2一烯-2-甲酸-水合物。按无水物计算，含C15H14CIN3O4S不得少于95.0%。

样品为白色、类白色或微黄色粉末或结晶性粉末；微臭，味苦。

样品在水中微溶，在甲醇、乙醇、氯仿或二氯甲烷中几乎不溶。

三、实训仪器与试剂

1．仪器

高效液相色谱仪；ODS分析柱。

2．试剂

头孢克洛对照品；头孢克洛δ-3-异构体对照品。

四、实训步骤

1．色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并稀释至1000mL，用磷酸调节pH至3.4)-乙腈(92：8)为流动相；流速为每分钟1mL；检测波长为254nm。同时精密称取头孢克洛对照品及头抱克洛8-3-异构体对照品适量，加流动相溶解并制成每1mL中分别含头孢克洛及头孢克洛δ-3-异构体约0.2mg的混合溶液，进样测试，头孢克洛峰与头抱克洛δ-3-异构体峰的分离度应符合规定。理论板数按头孢克洛峰计算应不低于1500。

2．含量测定方法

取本品约20mg，精密称定，置于100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，取20μL注入液相色谱仪；另取头孢克洛对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中C15H14CIN3O4S的含量。

cx=cR(Ax/AR)

式中cx——供试品含量；

cR——对照品含量；

Ax——供试品峰面积；

AR——对照品峰面积。

五、注意事项

(1)HPLC测定中流动相使用前必须经过滤膜过滤和超声脱气。

(2)HPLC测定完毕后，必须用水冲洗系统30min以上，然后再用甲醇冲洗。更换流动相时必须先停泵，待压力降至零时，将滤头提出液面，置于另一流动相溶液中。

(3)对照品溶液与样品液必须分别重复进样3次，取平均峰面积进行计算。

(4)外标法测定含量，样品处理中应严格定量操作。

(5)为获得高的精密度，进样量必须大于定量环容积的2-3倍。