（一）实验目的

1．了解和学习水中总大肠菌群的测定原理和测定意义。

2.掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的操作步骤。

(二）实验原理

将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检素表中查出大肠菌群的近似值。多管发酵法可用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检验。

（三）培养基与试剂

1．乳糖蛋白陈培养液

乳糖蛋白陈培养液成分：蛋白胨l0g，牛肉膏3g，乳糖5g,NaCl5g,16g/L溴甲酚紫乙醇溶液lmL，蒸馏水1000mL,pH为7.2-7.4。将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2-7.4,再加入16g/L溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min,贮存于冷暗处备用。

2．二倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养液

将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩2倍配制。

3．伊红美兰培养基

伊红美兰培养基成分：蛋白胨l0g,磷酸氢二钾2g，乳糖l0g,20g/L伊红水溶液20mL,5g/L美蓝溶液13mL,琼脂20-30g,蒸馏水1000mL,pH7.2。将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于蒸馏水中，调整pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，115℃高压灭菌20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美兰溶液，混匀，倾注平皿。

4．革兰染色液

结晶紫染色液：结晶紫1g,95％乙醇20mL,l0g/L草酸铵水溶液80mL。将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰碘液：碘1g，碘化钾2g,蒸馏水300mL。将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少量，充分振荡，待完全溶解后，再加入蒸馏水。

脱色剂：、95％乙醇。

沙黄复染液：沙黄。.25g,95％乙醇l0mL,蒸馏水90mL。将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后，再加入蒸馏水。

染色法：将培养18-24h的培养物涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染Imin，水洗；滴加革兰碘液，作用lmin，水洗；滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗；滴加复染液，复染lmin，水洗，待干，镜检。

5．仪器

培养箱36℃±1℃、冰箱、天平、显微镜、培养皿（直径9cm)、试管、分度吸管、锥形瓶、小倒管、载玻片。

（四）实验操作方法

1．乳糖发酵试验

取l0mL水样接种到l0mL双料乳糖蛋白膝培养液中，取1mL水样接种到l0mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到l0mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。

对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次，可直接接种5份l0mL水样效料培养基，每份接种10mL水样。

检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1mL、0.1mL、0.0lmL甚至0.1mL、0.0lmL、0.00lmL，每一稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。

将接种管置于36℃±1℃培养箱中，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。

2．分离培养

将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18-24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰染色、镜检和证实试验。

深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。

3．证实试验

经上述染色镜检为革兰阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置于36℃±1℃培养箱中，培养24h±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。

（五）结果计算

根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均为阴性，可报告大肠菌群未检出。