（一）实验目的

1．学习水样的采样方法和水样细菌总数测定的方法。

2．了解水源水的平板菌落计数的原则。

（二）实验原理

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。

（三）培养基与试剂

1．营养琼脂制备

营养琼脂成分：蛋白胨l0g，牛肉膏3g,氯化钠5g，琼脂10-20g,蒸馏水1000mL,pH为7.4-7.6。将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂，置于蒸馏水中加热溶解，调节pH为7.4-7.6.混合后，过滤除去沉淀，分装于玻璃容器中，经121℃高压蒸汽灭菌20min,贮存于暗处备用。

2．仪器

高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、培养箱（(36℃±1C)、电炉、天平、冰箱、放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、灭菌锥形烧瓶、灭菌的带玻璃塞瓶、灭菌平皿（直径9cm)、灭菌吸管。

（四）实验操作方法

1．水样的采集

(1)生活饮用水（自来水）

先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌锥形烧瓶接取水样，以待分析。

(2）水源水（池水、河水或湖水等）

应取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检测，否则需放入冰箱中保存。

2．细菌总数测定

(1）生活饮用水（自来水）

以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h,进行菌落计数，即为水样1mL中菌落总数。

(2）水源水（池水、河水或湖水等）

以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混成1；10稀释液。吸取1：10稀释液1mL注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混成1：100稀释液。按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。

用灭菌吸管取未稀释的水样和2-3个适宜稀释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h,进行菌落计数，即为水样1mL中菌落总数。

3．菌落计数

培养后，立即进行平皿菌落计数。进行平皿菌落计数时，可用菌落计数器或放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，计算出原始样品中每每毫升中的菌落数，进行报告。

（五）结果计算

细菌总数是以每个平皿菌落的总数或平均数乘以稀释倍数而得来的。各种不同情况的计算方法如下。

1．先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

2．首先选择平均菌落数在30-300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。

3．若有两个稀释度的平均菌落数均在30-300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。

4．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

5．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

6．若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

（六）说明及注意事项

1．稀释水样时，每稀释一次，需更换一支1mL灭菌吸管。

2．操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。

3．吸液体时液体不能进入吸头。

4.样品稀释时一定要混匀。

5．倒培养基前，瓶口要过火焰。

6．一定要有空白对照。

7．培养基温度、培养基薄厚应控制好。

8．检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。