(5) Evolution 220分光光度计的几种测试方法

本实验室的Evolution 220分光光度计共有Fixed, Scan, Quant, Rated等测试方法：仪器采用模块化设计，在智能恒温八联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球之间可以互相更换，根据测试条件的不同，选择不同的部件进行测试，更换的端口如图13-12和图13-13所示，图13-12是分光光度计放置智能恒温八联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球更换端口，图13-13是数据接口接入端口的示意图。

图13-12智能恒温八联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球更换端口

图13-13数据接口接入端口示意图

1) Fixed法。

固定波长测量一般是用来测试液体样品在特定浓度下的吸光度的测试方法，即Fixed法。

紫外-可见吸收光谱遵从朗伯-比尔定律：

式中，A为吸光度；I_o、I分别为入射光、透射光的强度；c为溶液的摩尔浓度；I为样品池的长度；在c 用摩尔浓度、I用厘米为单位表示时称。为摩尔吸光系数，而当浓度或液层厚度用其他单位表示时就称吸光系数，常用k表示。
因此，对于单一溶质溶液，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，即可求出溶液中物质的浓度和含量。该法不仅可以直接测定本身在紫外-可见光谱区有吸收的无机和有机物，还可以采用适当的试剂与吸收较小或非吸收物质发生显色反应，生成对紫外-可见光有强烈吸收的产物，从而对它们进行定量测定。

当溶液中含有多种对光产生吸收的物质，且各组分之间不存在相互作用时，该溶液对波长几的吸光度A^λ_总：

A^λ_总＝A^λ₁+A^λ₂＋A^λ₃＋…＋A^λ_n＝(ε^λ₁C1+ε^λ₂C2+ε^λ₃C3＋…+ε^λ_nCn)I（13-6)

偏离朗伯-比尔定律的原因有：①非单色光引起的偏离-入射光为非单色光；②散射光引起的偏离，常由溶液的不均性引起，实际样品的混浊、加入的保护胶体、蒸馏水中的微生物、存在散射以及共振发射等，均可引起吸光质点的吸光特性变化；③化学原因引起的偏离；④光程的不一致性。光源不是点光源、比色皿光径长度不一致、光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。

定量分析时一般使用标准曲线法。标准曲线法就是取已知浓度的样品在一定入射波长条件下测其吸光度的值，平衡地测量几组值，绘制标准曲线。从而在测量该物质的未知浓度的样品时可以通过样品吸光度得到样品浓度。

在定量分析时为了获得较高的测量灵敏度，入射波长应该选择被测物质的最大吸收波长。如遇干扰时，可选用灵敏度稍低，但能避免干扰从而进行定量分析的其他波长。如果无法获知被测组分的适宜定量分析的吸收波长，可通过对被测物质在紫外-可见光谱区的波长-吸光度吸收曲线，确定该物质的最大吸收波长，或适宜的定量分析测定波长。定量分析时其吸收度在0.3～0.7之间时测量精度较好，吸光度值最好不要超过0.2～0.8。可以从两方面提高测量精度：控制溶液浓度；选择不同厚度的吸收池。

在Fixed菜单下选择“setting”设置中的“instrument”，其中“date mode”中的数据模式有“absorbance”, “Yo transmittance”, “％reflectance”,“log( 1/R)”,“log(abs)”，可以根据不同的需要选择相应的数据模式。在“sample”中设置相应的待测样品个数。测试完成后软件会自动形成标准曲线。

2) Scan法。

Scan(扫描)法是测量液体或者固体紫外-可见连续曲线光谱，一般为200～800nm。在 “ Scan”菜单下选择“setting”设置中的“instrument”,“ date mode”中的数据模式一般选择“absorbance”，其他的参数可以根据待测样品要求进行，一般“bandwith”,“integration time”,“data interval”，选择默认值，如图13-14所示。

图13-14 Scan法测量参数设置

在“correction”菜单中做通过测试时，一般选择“100%T baseline”。在参数设置结束后便可以测量。

3) Quant法。

Quant法主要用来定量测试，紫外-可见吸收光谱遵从朗伯-比尔定律，具体原理参见fixed法部分。Evolution 220分光光度计提供6种不同方式进行便捷的定量分析：①手工输入因子；②测量单一标准；③标准曲线；④双波长的标准曲线；⑤高级标准曲线；⑥高级无标准分析。

可以进行多次计算分析，在一种分析方法中选取不同的参数，从而为特定的分析方法提供完整的答案。用定量分析方程计算复杂定量分析时一般使用标准曲线法。对于标准曲线的形式，在Quant菜单下选择“setting”设置中的“type”，一般选择“standard curve”，在“standards”中根据标准曲线的形式可以有不同种选择，在“curve fit type”中有“linear”,“ linear through zero”, “2nd order polynomial”等。选择样品个数便可以测量。

4) Rated法。

Rated法的动力学分析一般用得较少。在动力学分析中，每个样品池每秒可以采集到100个数据点，从而让动力学分析有充分的数据支持，可分段测量，并配合不同的采样密度和采样时间，利用驻留时间(dwell time)特性，在每次测量中采集到更多的数据，并得到快速反应的曲线，适用于零级、一级和二级反应以及连续反应机理的研究，数据分析也可采用分段处理，使全部分析更具灵活性。

(6) Evolution 220分光光度计的主要技术性能指标

光谱带宽：1nm、2nm。

光源：氙灯(使用寿命为10年，3年保修)。

检测器：硅光二极管。

波长范围：190～1100nm；波长精度：±0.8nm(全波长)；波长重复性：＜0.1nm;

扫描速度：<1nm/min到6000nm/min。

回转速度：31000nm/min。

吸光度范围：＞3.5Abs。

吸光度精度：0.5A，±0.004A; 1A，±0.006A; 2A，±0.010A。

噪音：0～0.00015 A。

漂移：＜0.0005A/h。

杂散光：KC1,198nm, <1％ ; NaI, 220nm, <0.05％；基线平直度，±0.0010A(200～800nm范围)。

详细性能如表13-2所示。

表13-2Evolution 220分光光度计性能