拉曼频移不随入射光频率变化，只与样品分子的振动和转动能级有关。其强度可表示为

φ_k=S_kφ0LHN4πsin² (a/2)                   (15-1)

式中，φ_k为在垂直入射光方向上收集到的拉曼散射光通量，W; S_k为拉曼散射系数，为10^-28～10^-29 mol/sr; φ₀为入射光照射到样品上的光通量，W;L为与折射率和样品内场效应等因素相关的系数；H为样品被检测的体积；N为单位体积内散射分子的数目；a为拉曼光束在聚焦透镜方向上的半角度。利用公式(15-1)，可对散射分子的结构和浓度进行分析和研究。

拉曼光谱和红外光谱均属于分子振动和转动光谱，红外光谱解析中的定性三要素(吸收频率、强度和峰形)对拉曼解析也适用。在许多情况下，拉曼频率位移的程度正好相当于红外吸收频率。因此红外测量能够得到的信息同样也出现在拉曼光谱中。但由于这两种光谱的分析机理不同，在提供信息上也是有差异的，极性官能团的红外谱带较为强烈，而非极性官能团的拉曼散射谱带较为强烈。例如，在许多情况下，C－C伸缩振动的拉曼谱带比相应的红外谱带强烈，而C－O伸缩振动的红外谱带比相应的拉曼谱带更为显著。此外，分子的对称性越高，拉曼光谱与红外光谱的区别就越大。

拉曼光谱技术具有自身的优点：①制样简单，气体样品可采用多路反射气槽测定。液体样品可装入毛细管中测定，不挥发的液体可直接用玻璃瓶装盛测量，固体粉末可直接放在载玻片上测试。②由于激光束的直径较小，且可进一步对焦，因而微量样品即可测量。③水是极性很强的分子，红外吸收非常强烈。但水的拉曼散射却很微弱，这对生物大分子的研究非常有利，此外玻璃的拉曼散射也较弱，因而玻璃可以用作窗口材料。④对于聚合物大分子，拉曼散射的选择定律被放宽，拉曼谱图上可以得到丰富的谱带。⑤拉曼光谱的频率不受单色光频率的影响，因此可根据样品的性质选择不同的激发光源，对于荧光强的一些物质可以选择长波长或短波长的激发光。

实验室使用的是Renishaw (inVia)激光共焦显微拉曼光谱仪，由英国雷尼绍公司生产(图15-4)。主要性能参数如下：可见光(514nm)和近红外(785nm)激光器及光路各一套，低波数到100cm^-1，采用三点精确机械定位方式，计算机控制不同波长滤光片之间的自动转换。自动xyz三维平台，最小步长为0.1 um，采用光栅尺反馈控制，确保高重复性，重复精度小于0.2um，可进行分散的多点、线、面的扫描和共焦深度扫描。

图15-4Renishaw(inVia)激光共焦显微拉曼光谱仪

具体实验操作步骤如下。

1．开机

1)打开主机电源。

2)打开计算机电源。

3)打开显微镜电源。

4)打开将使用的激光器电源。

514nm/633nm：打开控制模块电源开关一打开控制模块钥匙一打开功率显示模块钥匙。

325nm/785nm：直接打开激光器电源开关。

5)将Interlock盒开关选至所用激光器位置。

2.自检

1)用鼠标双击“Gramns”图标，进入仪器工作软件环境。

2)点击菜单中的“Collect”命令，选择“System check”命令执行(或Collect-System Setup-Gencral-Check Positions)，系统将自动检查所有的电机。时间需3～5min。

3)用50倍物镜，1s曝光时间，50um狭缝，514nm激光，100％功率取谱。使用标峰命令检查峰位。

4)参数获得：

用鼠标左键选中主峰区域；

放大；

点击“CRV”，命令按钮(或者菜单中“Arithmetic”，命令，选最后一个“Curve Fit”命令执行)；
用鼠标右键在谱峰内部任意一点点击，然后选择命令按钮“Done”;

选“Iterate”命令执行，Start Fit, OK，执行View Peaks命令，再选择“Parame-ters”，此时能看到上述所有参数；

点击“Parameters”,“Exit”,“Quit”,“ Exit”，退出此功能界面。

如果发现峰位偏差，可以用菜单中Collect - Application，执行第一项Calibrate system，输入希望纠正的值，Apply→Done。

3.实验

(1)实验条件设置。

1)点击设置按钮(或者菜单中Collect-Experiment Setup)，检查(设置)下列参数：

Type：Grating, Spectrum, Static (Extended)；

Center at(Range)：设置主峰中心位置(Static)或扫描范围(Extended);

Units：横坐标的单位，可以是纳米(nm)、拉曼位移(Shift) cm-1、绝对波数Abs/cm;

Detector：设置曝光时间；

Misc：累积次数；Cos. Ray Rem：宇宙射线；Objective：物镜倍数；

Laser：514nm或785 nm; Power：激光功率设置；

Grating(光栅)：1800 Line/mm对应514nm,1200 Line/mm对应785nm;

Descriptor：备注。

2)命令按钮含义。

OK：采用当前设置条件，并关闭设置窗口；

Apply：应用当前设置条件，不关闭窗口；

Image Area：检查或设置CCD窗口(使用区域)；

Load：调出并使用以前存储的实验条件，文件的扩展名为．rss;

Save：保存当前实验条件，方便以后调用。

Help：关于实验条件设置部分的帮助。

(2)采谱

1)点击“Get”(或Cycle Get)命令按钮(或菜单Collect命令→Get, CycleGet)；

2)菜单中File→Save(Save as)将谱文件保存到硬盘。

4．关机

1)关闭计算机：①关闭Gramns软件；②Start→Shut Down→Shut Down→OK。计算机将自动关闭电源。

2)关闭主机电源。

3)关闭显微镜电源。

4)关闭激光器。①将功率显示器上搬动开关搬到Stand by状态，然后关闭钥匙；②关闭激光控制模块上的钥匙，此时激光器散热风扇继续运转；③等待大约10min，用手试一下激光器风扇上方，没有明显的热感，即可关闭控制模块的电源开关。