一、大肠菌群作为卫生指标的意义

从卫生学上来看，天然水的细菌性污染主要是由于粪便污水的排入而引起的，也就是说，水中的病原菌很可能是肠道污染病菌。所以对生活饮用水进行卫生细菌学检验的目的，是为了保证水中不存在肠道传染病的病原菌。水中存在病原菌的可能性很小，而水中各种细菌的种类却很多，要排除一切细菌而单独检出某种病原菌来，在培养分离技术上较为复杂，需较多的人力和较长的时间。因此，一般不直接检验水中的病原菌，而是测定水中是否有肠道正常细菌的存在。若检出有肠道细菌，则表明水被粪便所污染，也说明有被病原菌污染的可能性。只有在特殊情况下，才直接检验水中的病原菌。

根据上述要求，选定大肠菌群作为检验水的卫生指标，因为大肠菌群的生理习性与伤寒杆菌、副伤寒杆菌和痢疾杆菌等病原菌的生理特性较为相似，在外界生存时间也与上述病原菌基本一致。而肠球菌的抵抗力弱，生存的时间比病原菌短，水中若未检出肠球菌，也不能说明未受粪便污染，一般肠球菌69万个/ml粪水；产气荚膜杆菌因为有芽孢，能在自然环境中长期生存，它的存在不足以说明水是最近被粪便污染，一般为1700个/ml粪水。大肠菌群在人的粪便中数量很多，健康人每克粪便中平均含5000万个以上，一般每毫升生活污水中含有大肠菌群83万个以上；检验大肠菌群的技术并不复杂，根据上述理由将大肠菌群作为水的卫生细菌学检验指标确是比较合理的。

选作卫生学指标的必须符号下列要求：

1．该细菌生理习性与肠道病原菌类似，因而它们在外界的生存时间基本一致；

2．该种细菌在粪便中的数量较多；

3．检验技术较简单。

肠道正常细菌有3类：大肠菌群、肠球菌和产气荚膜杆菌。

二、大肠菌群的形态和生理特性

大肠菌群一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸橼酸盐杆菌和副大肠杆菌。

大肠埃希氏杆菌有时也称为普通大肠杆菌或大肠杆菌。它是人和温血动物肠道中的正常寄生细菌。一般情况下大肠杆菌不会使人致病。在个别情况下，发现此菌能战胜人体的防卫机制而产生毒血症、腹膜炎、膀胱炎及其他感染。从土壤或冷血动物肠道中分离出来的大肠杆菌大多是枸橼酸盐杆菌和产气杆菌；另外，也往往发现副大肠杆菌。副大肠杆菌主要存在于外界环境或冷血动物体内，但也常在痢疾或伤寒病人粪便中出现。因此，如水中含有副大肠杆菌，可认为受到病人粪便的污染。

大肠埃希氏杆菌是好氧及兼性的革兰氏染色阴性，无芽孢，大小约为0.5～0.8×2.0～3.0um，两端钝圆的杆菌，生长温度10～45℃，适宜温度37℃，生长pH范围4.5～9.0，伤寒的pH值为中性，能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多种碳水化合物，并产酸产气，所产生的CO₂和H₂之比为1：1，即CO₂/H₂=1，而产气杆菌的CO₂/H₂=2。大肠杆菌的各类细菌的生理习性都相似，只是副大肠杆菌分解乳糖缓慢，甚至不能分解乳糖，并且它们在品红亚硫酸钠固体培养基(远藤氏培养基)上所形成的菌落不同；大肠埃希氏杆菌菌落呈紫红色金属光泽，直径约2～3mm；枸橼酸盐的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌菌落呈淡红色中心较深，直径较大，一般约4～6mm；副大肠杆菌的菌落则无色透明。

目前国际上检验水中大肠菌群的方法不完全相同。有的国家用葡萄糖或甘露醇作发酵试验，用43～45℃的温度培养。在此温度下，冷血动物和水、土壤中枸橼酸盐杆菌和产气杆菌多不能生长，培养分离出来的是寄生在人和温血动物体内的大肠菌群。因为副大肠杆菌分解乳糖缓慢或不能分解乳糖，采用葡萄糖或甘露醇而不用乳糖则可检出副大肠杆菌，而且在43～45℃下培养出来的副大肠杆菌，常可代表肠道传染病细菌的污染。还有的国家检验水中大肠菌群时，不考虑副大肠杆菌。因为人类粪便中存在着大量大肠埃希氏杆菌，在水中检出大肠埃希氏杆菌，他们认为就足以说明此水已受到粪便的污染，因此采用乳糖作培养基。由于大肠埃希氏杆菌的适宜温度是37℃，所以培养温度也不采用43℃而采用37℃。这样可顺利地检验出寄生于人体内的大肠埃希氏杆菌和产气杆菌。生产实践表明，这种检验方法一般可保证饮用水水质的安全可靠。

三、生活饮用水细菌卫生标准

长期实践表明，总大肠菌群数100ml水中不得检出，而根据滤膜法测定大肠菌群，其标准为每升水中大肠菌群数不超过3CFU。

四、革兰氏染色原理

通过初染和媒染后，在细菌细胞的细胞壁和膜上结合了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物，革兰氏阳性细菌胞壁较厚、肽聚糖含量较高和分子交联度较紧密，故在酒精脱色时，肽聚糖网孔会因脱水而发生明显收缩，再加上它不含脂类，酒精处理液不能在细胞壁上溶出大的空洞或缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍阻留在细胞壁上，使其呈现出蓝紫色。与此相反，革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄、肽聚糖位于内层且含量低和交联松散，与酒精反应后其肽聚糖不易收缩，加上它的脂类含量高且位于外层，所以酒精作用时细胞壁上就会出现较大的空洞和缝隙，这样，结晶紫和碘的复合物就很容易被溶出细胞壁，脱去了原来初染的颜色。当蕃红或沙黄复染时，细胞就会带上复染染料的红色。

1．革兰氏阳性菌的pH=2～3比G-的pH=4～5为低，所以在同-pH下阳性菌所含的阴电荷较多，获取碱性燃料的作用也较强。

2.碘进入菌体后与染料结合成一种复合物，不溶于水，稍溶于酒精和丙酮中，并能与G⁺核糖核酸镁盐结合，使染色更牢固。

3．脱色剂能将G^-体内的染料复合物溶解后流出，而对于G^＋的脱色就不明显，一方面由于染料复合物结合牢固，另一方面细胞壁脱水而收缩，改变酒精的渗透性。

4．复染时染料无法进入G⁺体内，而使G^-染上颜色。

五、革兰氏染色步骤

涂片→干燥→固定→结晶紫染色(冲洗和吸干)，媒染碘液(冲洗和吸干)→脱色(冲洗、吸干)→复染(冲洗、吸干)→镜检→清洗。

注意：1．清洗：载玻片浸入0.2％过氧乙酸2h，取出擦干净后浸入95％乙醇中；

2. G+：紫色；G^-：红色。

六、影响G染色的因素

1. pH值变动，导致细菌所带电荷的变化；

2．脱色时间过长和过短都会带来错误；

3．涂片太湿，使酒精浓度变稀，强涂了脱色；

4．涂片太厚，染料重叠，使脱色不完全；

5．紫外线照射使G⁺→G^-。

七、G染色配方

1．结晶紫：

甲：2g结晶紫于95％乙酸→20ml。

乙：0.8g硫酸铵于80ml蒸馏水。甲乙两种溶液相混。

2．卢哥氏碘液：1gI₂+2gKI＋少许蒸馏水溶解→300ml。

3．脱色剂95％酒精。

4．复染液：0.25％蕃红或沙黄＋10ml95％酒精→加蒸馏水至300ml。

相关链接：总大肠菌群的测定（一）