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HPLC的检测器是关键部件之一,从仪器学理论来讲,它属于光机电计算机集成为一体的高科技产品。目前,全世界大约有近40多种HPLC检测器;但是,很多检测器的覆盖面很小,只适用于专用场合。(1)常用检测器现状。
①紫外检测器(UVD):HPLC最常用的检测器是UVD。它是使用最多,覆盖面最广的检测器,约占HPLC检测器使用覆盖面的75%。基本上可以适用干所有有紫外吸收的物质的分析检测。任何HPLC,至少要带有一个UVD。
②荧光检测器(FLD):FLD覆盖面约占HPLC检测器的15%;凡是有苯环的物质,基本上都是致癌物质,它基本上都发荧光;并且FLD具有灵敏度高等优点,所以,FLD的使用也非常广泛。
③示差折光检测器(RID) : RID是质量型的、非选择性的检测器;其覆盖面约占HPLC检测器的5%;但是,因为它受温度的影响很大,使用环境温度的微小变化,会对检测结果产生很大影响。一般来讲,其稳定性较差。
④蒸发光散射检测器(ELSD) :ELSD近几年发展很快,很多领域都大a采用;如2010年版的中国药典,就明确规定有近百种药品要求用ELSD检测;目前它的使用覆盖面已经大于RID,所以从发展来看,它将很快替代RID,其覆盖面估计可达到10%左右。
(2) HPLC检测器的进展。近几年,新型的HPLC检测器不断涌现,具体表现如下。
①质谱检测器(MSD) :MSD实际上就是用质谱仪器作为HPLC检测器(又被说为HPLC和MS联用仪器);它是质量型的检测器,属于一种非选择性的检测器,具有高灵敏度、更高分辨率(具有色谱分辨率+质谱分辨率)等优点。目前,国际上普遍非常重视这种检测器,它在食品、药品、农业、各种复杂体系的研究中,将有广泛的应用前景。因为前面已经介绍,此不赘述。
②蒸发光散射检测器(ELSD):ELSD的工作原理是将色谱洗脱液雾化后,向生成微粒成分照射光,并检测生产散射光。理论上说,蒸发光散射检测器可检测任何不挥发性物质成分。蒸发光散射探测器的灵敏度是折光检测器的10倍,但对小分子的物质成分灵敏度稍低,原因是小分子物质的分子较小。ELSD主要用于检测没有紫外吸收的物质。但是应注意不具挥发性的食盐不能用作洗脱液。
ELSD具有非选择性、灵敏度高等优点。2010版的中国药典明确规定很多药品必须要用ELSD检测,它是很多制药行业、药品生产和质检必须使用的检测器。它的稳定性大大优于过去使用较多的RID质量型检测器。所以,在药品检测领域,它具有很多优点,有可能会完全代替RID检测器。ELSD前面已经详细介绍,此不赘述。
③激光诱导荧光检测器(laser induced fluorescence detector, LIFD)随着人类基因组学计划接近尾声,后基因组学与蛋白质组学正在成为国际瞩目的研究热点,生命科学、生物技术以及生物制药等领域的“淘金热潮”已经在全球蓬勃兴起。反映到作为“淘金”工具的分析仪器上,科技工作者们对现有分析手段的分离效率、分析速度、检测灵敏度有了更高的要求,特别是对其中检测技术的需求,更趋向于高灵敏度、高选择性的方向。激光诱导荧光检测技术(LIFD)正是集中体现了这种发展趋势。
1977年,Zare在分离维生素B时首次将激光诱导荧光检测器(LIFD)引入到微径液相中。其后,激光诱导荧光检测器作为一种新型高灵敏度的检测器得到了广泛的应用,尤其是用在测定生物体中超痕量生物活性物质和环境中有机污染物方面更具有优越性。与现有的其他检测方式相比,激光诱导荧光检测器具有最高的灵敏度(10-12 mol/L),利用激光诱导荧光检测技术可对单细胞中的核酸进行定量分析,对某些荧光效率较高的物质甚至可达到单分子检测。
商品化的LIFD检测器产生于20世纪90年代初,目前,世界市场上只有为数较少的几家公司生产LIFD,如美国的贝克曼(Backman)公司和美国的美国通微(Unimicro)公司。其中,贝克受公司的LIFD只与其毛细管电泳仪配套销售,而美国通微公司的TriSepTM 2100 LIF型激光诱导荧光检测器,可以与常规液相色谱、微径液相色谱、毛细管电色谱、毛细管电泳及微流控芯片等联用,与多种分离技术间具有超强的匹配性。目前中国上海通微公司与美国通微公司合作,销售TriSepTM 2100LIF型激光诱导荧光检测器。
一般的荧光检测器采用普通氘灯或氙灯做激发光源,其波长输出连续可调,但光强较弱、激发效率低;而LIFD采用高强度、高相干性的激光光源,与普通光源比较,具有单色性好、聚光性能强、光子流量(photo flux)高等特点,大大提高了灵敏度(降低了检测限),最低检测浓度可达10-12 mo1/L。
LIFD的特点如下。
第一,单色性好,谱带宽度可达10-8以下,使溶剂的瑞利散射光和拉曼散射光的带宽为1.0nm(拉曼散射光固有带宽),因而可选择性地消除散射光对荧光信号的干扰。
第二,聚光性强,激光光束的发射角极小,可将激光光束聚焦成直径几微米的光点,能a高度集中,因而可以使液相色谱检测池体积减小,特别适用于目前正在发展的微径和毛细管液相色谱。
第三,激光作为相千光源,具有较高的光子流量,极大地增强了荧光检测的信噪比,有利于提高分析灵敏度。
目前,在LIFD系统中,激光光源主要以气体激光器为主,但该类激光器存在体积大、能耗大和成本高等缺点,在很大程度上限制了LIFD的广泛推广。半导体激光器(laser diode, LD)具有输出功率稳定、价格低、体积小、寿命长等优点,是LIFD比较理想的光源,但目前LD的发射波长多在远红外区,在此波长范围内,很难找到与其相适应的衍生化荧光试剂。另外一类是激光二极管泵浦固体激光器(laser diodedouble-pumped solid state laser, DPSS)作为一种新型激光光源,具有气体激光器不可比拟的优势,如体积小、使用寿命长、无须水冷、波动噪音小、供电简单、价格低廉。这类固体激光器输出功率可以达到几个mW,已足够满足荧光检测的需求。美国通微公司生产的TriSepTM-2100LIF激光诱导荧光检测器采用激光二极管泵浦固体激光器作为激发光源,具有不可比拟的优势。
TriSepTM 2100LIF激光诱导荧光检测器的具体性能技术指标如表2-10所示。
表2-10 TripSepTM 2100LIF激光诱导荧光检测器的具体性能技术指标
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