61．色谱柱中的流动相会排干吗？排干后会损坏色谱柱吗？

答：不少HPLC的使用者，有时忘记了及时向溶剂瓶里补充流动相，高压泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。这时是否会损坏色谱柱？色谱柱还能使用吗？事实上，高压泵将溶剂瓶中的流动相吸千，并不会造成色谱柱的损坏。即使高压泵中充满了空气，它也不会将空气送入色谱柱。因为高压泵只能输送液体，而不能输送空气。一般来讲，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生；只是操作者有可能忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。所以，有可能色谱柱两端的几个毫米处变干了。挥发掉所有溶剂使色谱柱变干，需要相当长的时间，即使色谱柱真的变干了，也不一定就报废了，可以用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。因为较低的表面张力有助于浸润填料表面，已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。所以，这时的色谱柱以1 mL/min的流速，大约经过1.5小时或更长时间的冲洗，能被彻底浸润，有可能恢复到正常状态。

62．平时应如何保养HPLC的高压泵？(或如何防止HPLC高压泵出现故障？)

答：HPLC的高压泵非常重要，它对整个HPLC系统的稳定性会有很大的影响。使用者若要保持HPLC高压泵的良好工作性能，必须注意以下几点。

(1)在使用前必须认真查阅有关高压泵泵操作手册中的有关说明和建议。

(2)使用高质量的试剂，建议最好使用HPLC级的试剂。

(3)对流动相和溶剂必须认真过滤。

(4)必须认真对流动相脱气。开机使用前，应该先对高压泵放空排气；工作结束后应该从高压泵中洗去缓冲液。

(5)不让腐蚀性溶剂滞留在高压泵中。

(6)定期更换密封垫圈。

(7)如果需要，应该对高压泵的关键部位加润滑油，保持润滑，减少磨损。

(8) HPLC系统如果长期不用，应该每个星期开机半小时以上(一般开机1小时)。

(9)为了使分析测试结果的色谱图的基线平稳、保留时间的重复性好，在等度洗脱时压力波动应该小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳状态。

(10)为了尽快排除高压泵所发生的各种故障，平时应常备有关的卡套、密封垫、单向阀、各式接头、泵头装置附件、保险丝、有关工具等，以便能及时、快速地排除高压泵的各种故障。

63．如何解决HPLC的色谱柱压力不稳定的故障？

答：这个问题比较复杂，因为HPLC系统是一种精密的仪器，很容易出故障；即使在使用过程中按照正确操作规程进行，也会经常产生故障。一般最常见、出现频率最高的故障是色谱柱压不稳定。色谱柱压的稳定性直接影响分析测试数据的可靠性和RSD、色谱图峰形的好坏等。所谓色谱柱压稳定并不是指压力稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50psi(3.3 bar)左右(在使用梯度洗脱时，色谱柱压平稳缓慢地变化是允许的)。如果压力波动范围超过50psi(3.3 bar)，就属于色谱柱压不稳定，就需要排除产生色谱柱压不稳定的故障，一般排除方法如下。

(1)色谱柱压力过高。这是HPLC在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般由于流路中有堵塞而引起。对此，我们应该分段进行检查。

①断开高压泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则显然是溶剂过滤头堵塞。处理方法：取下过滤头，用超声波超洗30分钟，或用30％的硝酸浸泡30分钟，再用超纯水冲洗干净。此时如果液体通畅滴下，说明溶剂过滤头正常，否则再进一步检查。

②打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤器堵塞。处理方法：将过滤器取出，用10％的异丙醇超声30分钟。如果压力降至100psi(6.7bar)以下，则过滤器正常。否则，应该进一步检查。

③把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。解决的方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95℃的水冲洗至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲洗至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗后压力仍不下降，则可考虑将色谱柱的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，就只有更换柱子入口筛板。但这种方法一旦操作不慎，很容易造成柱效下降，所以应该非常慎重或尽量少用。

(2)色谱柱压力过低。色谱柱压力过低的现象，一般是由于系统泄漏。解决的方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。色谱柱压力过低，还有可能是泵里进了空气，这时除了压力过低外，还往往表现出是压力不稳、忽高忽低，更严重的是会导致高压泵无法吸上液体。解决方法：打开Purge阀，用5mL min以上的流速冲洗，如果不行，则要用专用针简在排空阀处将气泡吸出。

64．如何解决HPLC的基线漂移问题？

答：这也是个HPLC工作者经常会碰到的、比较难解决的问题；一般说来，仪器刚启动时，基线容易漂移，大概需要半个小时左右的平衡时间。如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，或者是在低波长下(200～20nm)，平衡时间会相对比较长。一般情况下，如果发现HPLC的基线漂移，应该考虑以下几个方面。

(1)检测器光源的电源是否出现故障，或者检测器的光源寿命是否到期，这些都会使HPLC系统产生漂移；解决方法：检查维修光源的电源，更换新的氘灯。

(2)检测器的电子学部分是否产生了故障，例如放大器产生了漂移或检测器的光电转换器件出现了漂移；解决方法：检查放大器等电子元器件，若发现问题，及时解决之。

(3)检测器波长设定是否正确，是否设定在最大吸收波长处；解决方法：将波长调整至最大吸收波长处即可。

(4)检查色谱柱的温度波动；解决方法：控制好色谱柱和流动相的温度，检查周围环境是否有影响，例如开窗户或使空调对着柱温箱等。

(5)检查样品中是否有强保留的物质(高K'值)以馒头峰形式被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线；解决方法：使用保护柱或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

(6)检查流通池是否被污染或有气泡；解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(最好断开柱子)，如有需要，可以用1N的硝酸冲洗15分钟。

(7)检查流动相的pH是否调节好；解决方法：认真调pH，加适量的酸或碱，将pH调至接近最佳值。

(8)检查流动相是否被污染、是否变质或是否用了低品质的溶剂配制移动相；解决方法：检查流动相的组成、配制日期，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂配制移动相。

65．如何解决HPLC保留时间漂移的问题？

答：对HPLC分析工作者来说，保留时间的重现性，是HPLC性能好坏的一个重要标志。同一种物质两次的保留时间相差不能超过10s，超过了10s就可认为保留时间漂移了，就无法进行定性；这时，必须考虑以下问题。

(1)色谱柱本身质量出现问题，色谱柱寿命到期。解决方法：检测色谱柱质量；更换新色谱柱。

(2)温度控制不好引起保留时间漂移。解决方法：调节柱温，保持柱温稳定；检查是否有环境因素对柱温箱产生影响。

(3)色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。

(4)流动相比例变化。解决方法：检查梯度比例阀是否有故障。

(5)移动相流速不稳定，变化超过要求范围。解决方法：重新设定流速，检测流速的稳定性。

66. HPLC为什么产生负峰？如何解决峰型异常的问题？

答：HPLC使用者会经常碰到这个问题；产生的原因很多，应仔细排查。

峰形异常(怪峰或鬼峰)是色谱实验中不希望出现的非真实峰，通常分为三类：残留或记忆峰、假峰、畸变(失真)。产生原因和解决方法如下。

(1)残留或记忆峰。一般是由阀、检测器的流动池死角、手动进样时进样针头沾污引起；解决方法：可以冲洗阀、流动池、进样针等。

(2)假峰。与分析样品无关的峰，在检测器高灵敏度时易出现，一般不易排除，与样品的保留时间有关；有时假峰的确是真实物质产生的峰，它来自于进样阀零件被污染、样品前处理时产生降解或混入杂质；流动相被污染、前一次进样的洗脱物污染等引起；有时还出现两个或多个未被完全分离的峰；解决方法：可以适当降低检测器灵敏度、重新配制流动相、清洗进样阀等。

(3)畸变(即峰失真)。一般来自于进样阀的外部，包括干扰，或者试样浓度太高、进样太多使峰前沿凸起等；解决办法：消除干扰、重新配制试样、重新配制流动相、稀释试样或减少进样量等。

HPLC的峰型问题是一个需要特别重视的问题，HPLC工作者在分析测试过程中，往往要通过变换不同的色谱条件来改善不理想的峰型。我们对于各种各样的异常峰，要区别对待，要抓住主要问题，认真加以解决。一旦出现异常色谱峰，要认真考虑以下问题。

(1)所有峰均为负峰。信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡；检测器设置不正确；解决方法：针对以上情况做相应调整即可。

(2)一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

(3)色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确。

(4)所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。

(5)所出峰比预想的小。解决方法：样品浓度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确；定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

(6)出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护柱或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

(7)出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

(8)拖尾峰。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。

(9)前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

(10)出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用足够的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

(11)排除故障时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；通过更换组件来排查故障时，要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费，这是成功进行故障排除的关键。

67. HPLC的检测限(灵敏度)不够的主要原因是什么？解决办法有哪些？

答：HPLC使用者经常会在实际工作中碰到仪器的灵敏度不够问题。很多人会束手无策，作者认为应该从以下几个方面来考虑：首先，在微量分析工作中，一开始仪器就有灵敏度不够的问题，这是没有根据自己工作的实际挑选仪器的缘故。很多情况是仪器开始时灵敏度能满足使用要求，但是后来由于种种原因，灵敏度不够了，这时，应该考虑以下问题。

(1)样品的浓度不够，解决办法是增加样品浓度。

(2)样品没有从色谱柱子流出。可根据样品的化学性质改变流动相(组成或pH)或更换色谱柱柱子。

(3)检测器池窗片被污染。解决办法为清洗池窗。

(4)检测器的量程设置不合适，量程太大、衰减太多。可以调整衰减倍数或重新设置量程。

(5)检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数。

(6)样品的测试波长不在检测器的波长范围内(检测器为固定波长或波长范围太短)，根据样品的化学性质，调整测试波长或改换检测器。

(7)检测池中有气泡。解决办法为排气。

(8)流动相流量不合适。调整流速即可。

(9)检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

68．为什么HPLC色谱柱在正常工作几个小时后，柱压会突然升高？

答：HPLC的色谱柱压过高是HPLC使用者最常碰到的问题。究其原因有多方面，并且有时不是色谱柱子本身的问题。根据作者的经验，当碰到色谱柱压突然增高时，可按下述几个步骤检查。

(1)拆去保护预柱，看柱压是否还高，若柱压仍高，再检查。

(2)把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降。若不降，则是管路堵塞，需清洗；若压力下降，再检查。

(3)将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池)。这时，如果柱压仍不下降，再检查。

(4)更换色谱柱的入口筛板，若色谱柱压下降，说明溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。

(5)如果使用者开始设定的流速过高，一开机就会看到压力过高；解决办法是重新设置高压泵的压力。

(6)流动相或进样中有杂质，造成在线过滤器阻塞，会造成高压泵的压力突然升高；解决办法是过滤流动相或检查试样中的杂质。

(7)保护柱或其前筛板堵塞，会引起高压泵的压力突然升高；解决办法是换保护柱或换筛板。

(8)流动相S度过大会引起高压泵的压力突然升高；解决办法是调换流动相。

(9)色谱柱温过低会引起高压泵的压力突然升高；解决办法是调节色谱柱温的设置。

(10)缓冲盐结晶会引起高压泵或色谱柱堵塞，会引起高压泵的压力突然升高；解决办法是换流动相，并且认真冲洗一段时间后再进样。

(11)压力传感器出现故障，会引起高压泵的压力突然升高；解决办法就是维修压力传感器。

如果采用以上措施后，色谱柱压还是很高，就应该请仪器生产厂商的工程师来解决。

69. HPLC的峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

答：HPLC出现峰拖尾或双峰也是常见的形象，一般应该考虑以下可能出现的原因和解决的办法。

(1)由于使用时间长，筛板堵塞或色谱柱失效；解决办法是反向冲洗色谱柱，替换筛板或更换柱子。

(2)试样太稀或流动相的流速太慢，往往是色谱峰拖尾的因素；解决办法可以是浓缩试样、加大流动相的流速。

(3)存在干扰峰；解决办法是使用较长的色谱柱、改换另外的新流动相或更换选择性好的色谱柱。

(4)色谱柱中存在气泡；解决办法是加大流动相的流速，或用大极性的溶剂冲洗色谱柱。

70．如何解决HPLC的保留时间发生漂移的问题？

答：当HPLC的保留时间发生漂移，应该考虑采取以下解决办法。

(1) HPLC系统的高压泵的压力发生了变化，导致流动相的流速发生变化，从而引起保留时间发生漂移；解决办法是检查高压泵的压力和系统的流动相流速，使它保持恒定。

(2)色谱柱的温度控制不好，会引起保留时间发生漂移；解决方法是采用恒温装置，调节或保持色谱柱温度恒定。

(3)色谱柱没有平衡好引起的保留时间变化；解决办法是对柱子进行更长时间的平衡，一定要在色谱柱达到平衡后再开始进样。

(4)流动相不合适，它偶尔发生化学反应，也会使得保留时间发生漂移；解决办法是防止流动相发生化学反应(或者换流动相)。

(5)高压泵中有气泡会引起保留时间漂移；可通过排气等办法将气泡赶出。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（六）