(一)人工完全抗原的合成

1. 试剂与材料

①SM₂：磺胺二甲基嘧啶( Sulfamethazine, SMT)。

②BSA：牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumen)

③OVA：卵清白蛋白(Ovalbumin)。

④SA：丁二酸酐(Succinic anhydride)。

⑤EDC·HCl：1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺·盐酸盐。

⑥无水吡啶(Pyridine)。

⑦无水处理的二氯甲烷(CH₂Cl₂)。

2．实验方法

(1)半抗原SM₂-SA的制备SM₂-SA合成的方程式如图5-4所示。

①取1.405gSM₂溶于10mL无水处理过的吡啶。

②2.67g SA溶于5mL无水吡啶，与SM₂液混匀溶解。

③搅拌反应24h。

④反应液移入置有20mL水的100mL分液漏斗中摇匀静置。

⑤用15 mL CH₂Cl₂进行萃取，轻摇，注意放气。萃取3次，收集下层CH₂C1₂相。

⑥合并3次萃取CH₂C1₂ 相。用0.1 mol/L HCl溶液15 mL洗提，3次后用15 mL H₂O再洗一次。收集下层CH₂C1₂相。

⑦在萃取液中加入一定量的无水Na₂SO₄脱水。

⑧在蒸发皿中加入2mL甲苯，低温(35℃)蒸干。

图5-4 SM₂-SA合成方案方程式图

(2)琥珀酰化-水溶性碳化二亚胺法合成SM₂-BSA, SM₂-OVA(水溶性EDC法)

①称取BSA和OVA各200mg, 100mg SM₂-SA和100mg EDC中分别溶于5,2,3mL的PBS中。

②然后向BSA和OVA溶液中边搅拌边慢慢滴加2mL SM₂-SA溶液和2mL EDC溶液。在4℃冰浴下遮光反应4h。

再向混合液中滴加剩下的1 mL EDC溶液。继续于4℃冰浴下遮光搅拌反应24h。

③反应结束后4000r/min离心5 min，取上清液装入透析袋，用0.01mol/L pH 7.4 PBS在4℃透析2d(PBS：1.5mmol/L KH₂PO₄，8 mmol/L Na₂HPO₄，2.7mmol/L KCl，137mmol/L NaCI)，每天更换3次透析液。

④透析完毕后上sepHadex G-50层析柱，用100mmol/L pH 7.4 PBS洗提，留小部分鉴定，其余用冷冻干燥机干燥后分装。

合成路线如图5-5所示。

(二)合成抗原的鉴定

抗原合成结果进行SDS-PAGE分析和紫外光谱分析，并计算结合比测定。

(三)抗体的制备与纯化

1．兔免疫

第一次免疫取100 ug合成抗原与1mL弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(FCA-IgG )液，背部皮下散点注射各0.2mL左右。第二次免疫在3周后用弗氏不完全佐剂乳化注射。第三次、第四次免疫同第二次免疫方法，间隔为2周。抗血清效价达到要求以后采血。

2．抗体纯化

图5-5琥珀酰化-水溶性碳化二亚胺法合成SM₂_BSA方程式图

按饱和硫酸铵法和DEAE纤维素法进行。

3．结果鉴定

以双相琼脂扩散试验定性观察检测所获免疫血清的抗体质量，以直接竞争法确定抗血清效价。

(四)标准竞争抑制曲线的制作

1．包被微孔板  用乙醇-PBS(0.15mol/L, pH7.2)400倍稀释的SM₂-OVA人工抗原包被酶标板，150 uL/孔，4℃过夜。

2.稀释  将纯化抗体稀释80倍后分别与等量不同浓度的SM₂标准溶液用2mL试管混合振荡，使SM₂的最终浓度为10ug/mL、1ug/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL，分别加100uL/孔，4℃静置。

3．洗涤  取出酶标板恢复至室温，弃去包被液，每孔加300 uL洗涤液，静置3 min，弃去洗涤液，共洗3次，在吸水纸上将酶标板敲干。

4．封闭  加封闭液封闭，250uL/孔，置37℃下温育1h。

5.抗原抗体反应  酶标板洗3×3min后，加抗体抗原反应液(在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照，3孔；加抗原稀释液作为阳性对照，3孔)130 uL/孔，37℃，温育2h。

6.酶标记反应  倒掉反应液并拍干，酶标板洗3×3 min，拍干，加酶标二抗-羊抗兔HRP结合物(1:200，V/V) 100uL/孔，37℃下1h。

7.测定  酶标板用洗液洗5×3 min。加底物溶液A、B，各100uL/孔，37℃，温育15 min，然后加终止液，40 uL/孔，以终止显色反应，酶标仪450nm/630nm测出OD值。

8.作图

求出各孔的B校正值：B校正值＝OD实测值-空白对照孔OD值(均值)。

求出标准样的B/B₀值：B=[B校正值/阴性对照孔B₀校正值(均值)]×100。

以标准样浓度对数值为横坐标，B/B₀的均值为纵坐标作图。

(五)畜产品中SM₂残留的ELISA检测

屠宰现场取肝、肾、肌肉、血各100g。放入清洁保鲜袋内，加封，标明标记，保温冷藏及时送实验室。将试样分别放入高速组织捣碎机中捣碎，充分混匀，装入清洁的容器内，加封后，标明标记。应于-18℃冷冻保存。

1．样品预处理

样品处理：称取肉(肝、肾)均质后的样品20g置入250mL长颈瓶中，加入甲醇：水为80:20的溶液200 mL。摇匀后在70℃水浴中加热45 min。在摇床上振荡60min 1500r/min离心10min。用巴斯德吸管吸去脂肪层，取上清液低温蒸干后用含有0.0032% BSA的10mL乙酸溶液(pH7.0，10mmol/L)溶解。

2．IC-ELISA程序

(1)包被微孔板 用400幻倍稀释的SM₂-OVA人工抗原包被酶标板，150uL/孔，4℃过夜。

(2)将纯化抗体SM₂-BSA稀释80倍后分别与等量样品提取液(10倍稀释)用2mL试管混合振荡后，4℃静置(15 min左右)。

(3)洗涤取出酶标板恢复至室温，弃去包被液，每孔加300uL洗涤液，静置3min,弃去洗涤液，共洗3次，在吸水纸上将酶标板敲干。

(4)封闭加封闭液(1％的BSA)封闭，250 uL/孔(200)，置37℃下温育1h。

(5)抗原抗体反应酶标板洗3×3min后，加抗体抗原反应液(如表2-4所示，在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照，3孔；加抗原稀释液作为阳性对照，3孔)130 uL/孔，37℃，温育2h。

(6)酶标记反应倒掉反应液并拍干，酶标板洗3×3 min，拍干，加酶标二抗-羊抗兔HRP结合物(1:200, V/V)100uL/孔，37℃下1h。

(7)测定酶标板用洗液洗5×3 min。加底物溶液A、B、各100uL/孔，37℃，温育15min，然后加终止液，40uL/孔，以终止显色反应，酶标仪450nm/630nm测出OD值。

(8)计算求出各孔的B校正值：B校正值＝OD实测值-空白对照孔OD值(均值)。

求出标准样的B/B₀值：B=[B校正值/阴性对照孔B0校正值(均值)]×100。

对照标准曲线拟合方程，求出待测样SM₂含量(ng/mL)。

(六)方法评价

1．特异性

特异性是指本测定方法对被测物质的专一程度，一般用抗体交叉反应表示。该方法假定100％的被测抗原可与50％的抗体结合，那么可与50％的抗体结合的被测抗原类似物百分含量则为抗体与该类似物的交叉反应率(CR50%)。计算公式如下：

式中S—标准抗原的IC₅₀;

Z—抗原类似物与50％的抗体结合时的浓度。

2.灵敏度

本实验灵敏度即指应用该方法能检出待测物中SM₂残留的最低含量，即最小检出量(LOD),测定10个“0”标准管，求出光密度值的平均数，减去三倍的标准差再与的比值。对照标准曲线方程得出浓度值即为检测限值。

抗原浓度对数与吸光度值有较好线性关系的一段浓度值可以作为工作检测范围。测量限(LOQ)是指实际操作中半定量检测SM₂的最小测定量，通常被定为“0”管光密度值平均数的80%。

3．准确度

取有代表性的高中低三个浓度为目标浓度添加至空白猪血清中，混匀后进行IC -ELISA试验计算回收率。

4．精确度

批内误差：以标准缺陷的批内变异系数表示：

CV=SD的平均值/平均批内平均结合率×100(％)

批间误差：以3次测定的结合率进行平均，求出各浓度的批间变异系数，再平均求其总的批间变异系数。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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