(一)适用范围

本方法适用于转基因大豆及其初级加工产品中CP4 EPSPS蛋白的检测，也适用干含有CP4 EPSPS蛋白的其他转基因植物检测。

(二)实验原理

酶标板表面包被有特异的单克隆捕获抗体。当加上测试样品时，捕获抗体与抗原特异性结合，未结合的样品成分通过洗涤除去。洗涤之后，加入与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗体，该抗体可与CP4 EPSPS蛋白的另一个抗原表位特异结合，洗涤之后，加入辣根过氧化物酶的显色底物四甲基联苯胺。HRP可催化底物产生颜色反应，颜色信号与抗原浓度在一定范围内呈线性关系。显色一定时间后，加入终止液终止反应。在450nm波长测每一孔的光密度。

(三)试剂

1．检测试剂盒通常提供的试剂

(1)大豆抽提缓冲液硼酸钠缓冲液，pH 7.5,

(2)大豆分析缓冲液磷酸盐缓冲液，Tween-20, BSA, pH 7.4

(3)包被有单克隆捕获抗体的酶标孔。

(4)与辣根过氧化物酶偶联的兔抗。

(5)偶联抗体稀释剂10％热灭活的小鼠血清。

(6)显色底物。

(7)终止液0.5％硫酸。

(8)10倍浓缩的洗涤缓冲液PBS, Tween-20, pH 7.1,

(9)与基质匹配的阴性和阳性标准品，如0.1%、0.5%、1%、2%、5％。

2．其他需要准备的试剂

(1) 70％的甲醇溶液(体积比)取700mL甲醇加水定容至1000 mL。

(2) 95％的乙醇。

(四)仪器设备

1．通常实验室仪器设备。

2.酶标仪；多通道移液器。

3．孔径450 um的滤膜；孔径150 um的滤膜。

(五)操作步骤

1．样品的预处理

取500g以上大豆，粉碎、微孔滤膜过滤。在操作过程中小心避免污染，避免局部过热。定性检测的微孔滤膜孔径应为450 um，保证孔径小于450um的粉末质量占大豆样品质量的90％以上。定量检测的样品先用孔径为450 um的微孔滤膜过滤后，再经孔径为150um的微孔滤膜过滤，过滤得到的样品量只要能满足检测要求即可。对于其他类型的材料采用类似的方法处理。

在检测不同批次样品之间应将处理大豆样品的所有设备进行彻底清洁。首先，尽可能除去残留材料，然后用酒精洗涤两遍，用水彻底清洗，风干。同时，工作区应保持清洁，避免样品交叉污染。

2．样品抽提

测试样品、阴性及阳性标准品在相同条件下抽提两次。每一种标准品在称量时按照含量由低到高的顺序进行。

将每一种样品称出(0.5±10.01)g，放入15mL聚丙烯离心管中。为避免污染，在称量不同样品时，用酒精棉擦干净药匙并晾干，或使用一次性药匙。向每个离心管中加4.5mL抽提缓冲液。将缓冲液与管内物质剧烈混匀并涡旋振荡，使之成为均一的混合物(低脂粉末和分离蛋白质需延长混合时间，有时超过15 min；全脂粉末容易混匀，不超过5min)。4℃下5000×g离心15min。小心吸取上清液于另一干净的聚丙烯离心管中，每管吸取1mL上清液。上清液可于2～8℃贮存，时间不超过24h。

在检测前，用大豆检测缓冲液按比例稀释样品溶液，如表5-2所示。

表5-2 不同基质的稀释度

3. ELISA操作步骤

ELISA实验流程如表5-3所示。

表5-3 ELISA实验流程

(1)孵育在室温下，取出酶标板，加10 uL稀释的样品溶液及对照到酶标孔中，轻轻混匀。37℃孵育1h(每次加样应该更换一次性吸头，以免交叉污染。并使用胶带或铝箔封住酶标板，以免交叉污染和蒸发)。

(2)洗涤把10倍浓缩的洗涤缓冲液用水稀释10倍，用洗涤工作液洗涤酶标板3次。在此过程中，不要让酶标孔干，否则会影响分析结果；不管是人工洗涤还是自动洗涤，应确保每一孔用相同体积的洗液洗涤，以免出现错误的结果。
人工洗涤：将酶标板翻转，倒出微孔内液体。用装有洗涤工作液的500mL洗瓶，将每孔注满洗涤液，保持60s，然后翻转，倒掉洗涤液。如此重复操作总共3次。在多层纸巾上将酶标板倒拍数次，以去除残液(用胶带将酶标板条固定以免滑落)。

自动洗涤：孵育完毕，用洗板机将所有孔中的液体吸出，然后在每孔内加满洗涤液。如此重复3次。最后，用洗板机吸出所有孔中洗涤液，在多层纸巾上将酶标板反放拍干，以去除残液。

(3)加入偶联抗体根据使用说明，用偶联抗体结合稀释剂溶解抗体粉末得到抗体贮存液，于2～8℃贮存。

取240 uL偶联抗体贮存液，加入到21 mL偶联抗体稀释剂中得到偶联抗体工作液，于2～8℃贮存。

在每孔中加100 uL偶联抗体工作液，封闭酶标板，轻轻摇晃混匀，37℃孵育1h。

(4)洗涤洗涤方法同(2)。

(5)显色每孔中加入100 uL显色底物，轻轻摇动酶标板，室温孵育10min(加显色底物时应连续一次完成，不得中断，并保持相同次序和时间间隔)。

(6)终止反应按照加入显色底物同样的顺序向酶标孔中加入100 uL终止液，轻轻摇动酶标板10s，以终止颜色变化，并使终止液在孔中均匀分布(在加入终止液时应连续一次完成，不得中断，酶标板应注意避光，防止颜色深浅因受到光的影响而发生变化)。

(7)吸光值的测定在加入终止液30min之内用酶标仪在450nm波长测量每孔的吸光值(OD)。

记录所得结果，用计算机软件处理。

(六)测试样品中目标蛋白浓度的计算

测试样品及参照标准的数值需减去空白样的数值，所测量的阳性标准品的平均值用于生成标准曲线，测试样品的平均值根据标准曲线计算相应浓度。

(七)结果可信度判断的原则

对于阳性标准品(大豆种子)而言，该方法检测的灵敏度必须保证在0.1％以上，定量检测的线性范围是0.5％～3%。

每一轮检测都必须符合表5-4所列的结果可信度判断的原则。每一轮反应应当包括空白、阴性标准品、阳性标准品和测试样品。所有样品检测液、空白对照都必须设置一个重复：如果不符合表5-4中所列的条件，所有检测实验需重新操作。

表5-4 结果可信度判断的条件

(八)ELISA方法检测转基因产品的优点和局限性

1．优点

特异性高，获得结果快，仪器简单，易于操作，对人员要求不高。免去了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本，由于酶具有很高的催化效率，可极大地放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。

2．局限性

主要表现为：

①检测范围窄：ELISA分析需要转基因食品中含有待检测范围，如转EPSPS基因的耐除草剂大豆，转Bt基因的抗虫玉米等，因此只能在商业化GMF品种较少的情况下使用。目前商品化ELISA试剂盒只能检测少数几种GMF，且一种试剂盒只针对某一特定转基因产物，无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品。

②易出现假阴性结果：一方面转基因食品中“新蛋白”含量通常很低，多数在10-12～10-6数量级水平，难以检出，另一方面蛋白质在食品加工过程中易变性，已加工食品中的蛋白质很可能失去抗体所针对的抗原表位，从而造成 ELISA检测结果假阴性。此外蛋白质在受体生物基因组内表达前后如进行新的修饰，也可导致检测敏感性降低及假阴性结果。而有些转基因产品中的外源基因不表达蛋白质，则无法检测。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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