1.3测定方法与不确定度来源分析

1.3.1测定方法

操作流程如图1所示：

图1 操作流程

测定步骤如下：

(1)试验准备

单标线吸量管、容量瓶的清洗，比色皿、分度吸量管的清洗及灭菌，培养基、pH7.8磷酸盐缓冲液的准备，半无菌间的紫外消毒等。

(2)预试验

确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素溶液浓度、培养基等，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度巨检验标准中规定在35℃～37℃培养3h～4h后(本例培养4h)，使用微生物比浊法测定仪测定的吸光度在0.3～0.7，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1]。

(3)供试品、标准品溶液的制备

①供试品溶液的制备：供试品硫酸小诺霉素溶液为注射剂，精密量取3mL(VT取样＝3mL)～100mL“容量瓶(VT=100mL)中，加灭菌水至刻度，摇匀。精密量取上述供试品的灭菌水溶液2mL～100mL容量瓶中，加pH7.8磷酸盐缓冲液至刻度摇匀。再分别精密量取上述缓冲溶液5mL～100mL和200mL容量瓶中，分别加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得高、低浓度(理论浓度)分别为1.0u/mL，0.5u/mL的供试品溶液。

②标准品溶液的制备：精密称取小诺霉素标准品约0.039g(Ws=0.03916g)，置25mL容量瓶中(Vs=25mL)，加灭菌水至．刻度，摇匀。然后按供试品溶液制法，得到高、低浓度(理论浓度)分别为1.0u/mL、0.5u/mL的标准品溶液。

注：制备供试品、标准品的高低浓度溶液所用的2mL、5mL单标线吸量管和100mL、200mL容量瓶的容量和等级是相同的，并且体积在初始的计算公式(本案例未列出)中被约分了。此处认为它们的体积分散性也被抵消了。

(4)含试验菌液体培养基的制备

临用前，取试验菌悬液适量，加入抗生素检定培养基Ⅲ号中，混合均匀。立即使用，以防止试验菌在培养前生长。

(5)加样

用微量移液器精密吸取供试品和标准品溶液高低浓度溶液各1 mL，按拉丁方阵排列顺序放入特制的比色皿中，再用分度吸量管精密吸取含菌培养基9mL，放入比色皿中，摇匀。采取二剂量法，每一浓度组加4个比色皿，共16个比色皿一起放入微生物比浊法测定仪的培养箱中。

(6)空白管和阳性对照管的制备

①空白管：取一支比色皿，精密加入1mL缓冲液和9mL不带菌培养基，摇匀。

②阳性对照：取一支比色皿，精密加入1mL缓冲液和9mL带菌培养基，摇匀。

(7)培养

按照4×4拉丁方阵排列顺序(见图2)，将所有比色皿放入微生物比浊法测定仪中培养3h～4h(本例培养4h)，使测定的吸光度值在0.3～0.7。

(8)测量

本例开始实验40min后，每隔10min测量一次吸光度，共培养4h，共测量20组数据。测定效价时，选取一个培养时间点的一组吸光度原始数据(本例选取4.1.5.1.3小节表1中第3时间点的16个吸光度数据)计算效价，其抗生素高低浓度溶液的吸光度值均应在0.3～0.7。正常检验只测量一个样品试液，本例为了评定测量重复性不确定度分量，重复测量10次(10个平行样)，数据见4.2中表2。

A是阳性K是阴性

图2 拉丁方阵排列

(9)结果的可靠性检验及效价计算

①可靠性检验

偏离平行要求p>0.05,p指可靠性检验的置信概率。

可信限率FL≤7％。(按药典规定：“除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％”,小诺霉素属于“另有规定”类。)

本次测量，可靠性检验符合要求(详细检验过程与不确定度评定无关，此处从略)。

②效价计算

按式(1)计算效价：

式中：

Y—硫酸小诺霉素注射液的效价(百分比)，％；

W_S—标准品取样量，39.16mg;

V_T取样—供试品取样量，3mL;

V_s—标准品稀释体积，25mL;

V_T—供试品稀释体积，100mL;

R—供试品与标准品的效价比值，无量纲；

574—小诺霉素标准品效价，u/mg;

60—供试品规格，mg;

2—平均装量，mL;

1000—效价u到mg的换算因子，u/mg;

的计算结果，mL/mg。

式(1)中：

其中：

式中：D—标液和试液的理论浓度比值。

式中：I—为标液和试液相同剂量溶液的高低浓度理论比值的对数。

按下文4.1.5.1.3小节表1中第3个时间点的数据计算(以下同)，有：

式中：T₁、T₂、S₁、S₂分别为通过可靠性检验的4个吸光度值的累加和，T代表供试品，S代表标准品，下标1为低浓度，下标2为高浓度。以下同。

将式(3)～式(6)代入式(2)，得：

注：1g—以10为底常用对数，即1og₁₀，若有A=10^x，则1gA=x;

antilg—反常用对数，antilgA=10^x，即是求解真数10^x的值。

将式(1)代入数值，得：

以一次检验结果的Y值为测得值。

文章来源：《食品药品检测测量不确定度评定实例》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。