三、单克隆抗体的制备

根据抗体产生的克隆选择理论，哺乳动物体内每个淋巴细胞都有独一无二的受体特异性，因此而预先受到了约束，在受到适当抗原刺激后，只产生一种抗体。单克隆抗体是由一个抗体产生细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类别，而且因为它是针对单一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。单克隆抗体的制备是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。选经目标抗原免疫的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞[经8-氮鸟嘌呤或5-溴脱氧尿嘧啶核苷诱导产生的代谢缺陷型细胞，无胸苷激酶(TK)或次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)习，用聚乙二醇(PEG)等融合剂融合，然后将细胞悬浮在含次黄嘌吟、氨基嘧啶和胸腺嘧啶的培养液中，加入到96孔微量培养板培养。未融合的脾细胞在体外不能长期存活而死亡，骨髓瘤细胞也因为缺少次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)，不能合成核酸也将死亡。只有脾细胞和骨髓瘤细胞融合生成的杂交瘤细胞因为具有从脾细胞带来的TK和HGPRT而可以长期存活并生长繁殖。

如下是笔者实验室制备小分子化合物单克隆抗体的标准操作规程(SOP),供同行参考。

(一)动物免疫

1．基础免疫

一般的基础免疫动物选择6～8周龄的雌性BALB/C小鼠，小鼠体重以16～18g为宜。

免疫的抗原用生理盐水溶解、稀释，将1mg抗原中加入1mL生理盐水至终浓度为1mg·mL^-1。佐剂选择SIGMA公司福氏完全佐剂。

按照高、中、低三个剂量用生理盐水稀释抗原，高剂量按60ug·只^-1，中剂量按30ug·只^-1，低剂量按5ug·只^-1准备。稀释后的抗原与等体积的福氏完全佐剂混匀，混匀到油包水的状态即可，以滴入水中不会散开为好。再以0.2mL·只^-1，小鼠腹部皮下及脚掌多点注射，腹部约15点，每个脚掌各一点，腹股沟各一点。

2.加强免疫

首次加强免疫与基础免疫间隔时间为3周，免疫佐剂选择SIGMA公司福氏不完全佐剂，免疫剂量及方法同前。

第二次加强免疫与首次加强免疫间隔2周，免疫佐剂和方法同首次加强免疫，除低剂量组外，其他组剂量减半。

以后每次加强免疫与前一次加强免疫间隔时间均为2周，免疫佐剂和方法、剂量同第二次加强免疫。

3．血清鉴定

第二次加强免疫后7d即可眼周采集免疫鼠血液进行抗体鉴定。

(1)采血 用0.5mm直径的毛细管扎眼角采血约100碑、，插入到1.5mL EP管中，立即用洗耳球将血吹出以免凝固，碘酒擦小鼠眼睛消毒，4℃过夜后3000r·min^-1离心5 min收集上清液。

(2)测效价 一般包被抗原2ug·mL^-1，血清从1:100开始1:5梯度稀释,用酶稀释液进行稀释，结果效价在1:10⁴以上时为合格，我们将最高OD值的一半对应的稀释倍数认定为效价。

(3)测竞争 包被抗原2ug·mL^-1，标准品从1ug·mL^-1开始1:5梯度稀释，血清稀释根据测效价结果，选取OD值为1.5左右的稀释倍数进行竞争测定，结果IC₅₀在200×10^-9，以下较好。

(二)细胞融合

1．融合小鼠冲击免疫

融合前3d，选效价好且竞争好的小鼠进行冲击免疫，方法为尾静脉注射，抗原加生理盐水共200uL，抗原的剂量和基础免疫的剂量相同，其中5ug的抗原剂量需加倍。

2．融合用饲养细胞准备

取小鼠腹腔中的饲养细胞用于获得饲养细胞分泌的生长因子，一只小鼠可铺板3个96孔板。

在培养皿中加入35mL的16％ FBS的HAT培养基。

将小鼠脱颈致死，放入100mL 75％的乙醇中消毒1～3min，取出后，放入超净台，用镊子将小鼠腹部的外层皮肤剪开，上下用力拉，使小鼠的整个腹腔与皮肤分离暴露，喷洒75％的酒精，对腹腔膜进行消毒。

用5mL或10mL一次性注射器从培养皿中吸取5～10mL培养基，小心注入小鼠腹腔轻轻按压1 min，吸取腹腔内的培养基打入培养皿中。

将培养皿中的饲养细胞混合均匀后加入96孔板(100uL·孔^-1)，37℃、5％ CO₂培养箱中培养。

3.融合用SP2/0细胞准备

融合前4天复苏一只或两只SP2/0细胞，待密度达到50％左右可扩皿，需要扩成至少4个皿，每天传代一次，调整好密度，按经验保证在融合时其密度应在80％左右。每皿加入12mL的10％血清DVIEM完全培养基。

注：SP2/0细胞的状态对细胞融合很重要．若用含8-氮杂鸟嘌吟的培养基(8-AG)筛选，那么SP2/0在融合前至少2周应停止使用8-AG筛选培养基．使用前保证SP2/0细胞的生长密度为80％左右为宜，并保证SP2/0细胞在细胞融合时处于对数生长期。

4. 小鼠脾脏细胞获取

①准备好手术器械、2个培养皿，每个培养皿加入10mL SF培养基，将细胞过滤筛放入第二个培养皿中，并盖好。

②将待融合鼠摘眼球取血至1.5mL EP管．将血做好标记，常温放置2h后，4℃过夜，第二天离心取上清，-20℃冻存备用；摘眼球取血后老鼠颈椎脱臼处死，老鼠放到盛有100mL 75％酒精的小烧杯中，浸泡时间不要超过5min,准备取脾。

③将处死的老鼠从烧杯中取出，放到手术台中，喷酒精消毒后置于超净台中，老鼠侧放，左侧在上暴露，用一把镊子夹起腹中线皮肤，剪刀剪开一小黏口(注意不能剪太深，以防剪破腹膜)。换一把干净镊子撕开皮肤，暴露腹膜，喷酒精消毒，换干净镊子，在酒精灯外焰中消毒，等其冷却后在离脾脏稍远位置夹起腹膜，用十净剪刀(酒精灯外焰中消毒)先剪开一小口，再依次沿着脾脏周围一直剪开，换用干净的剪刀和镊子(酒精灯外焰中消毒)，用镊子夹起脾脏，将其拉出，用剪刀尽可能剪去周围粘连的脂肪，完成后，将取出的脾放到事先准备好的第一个培养皿中测洗，之后放入第二个培养皿的细胞筛网上，用尤菌的2mL注射器胶塞轻轻研磨脾脏，使脾脏组织分散为脾细胞，研磨结束后，用5mL移液管取3～5mL SF培养基冲洗细胞筛网，使上面的细胞通过筛网流至下面的培养皿中，并混匀所得细胞液，将其转移至15mL离心管中，静置5 min，等组织块沉降后取上清液转移至新的15mL离心管，混匀细胞液取样500uL用干计数。

5. SP2/0细胞和脾细胞的融合

按照SP2/0细胞：脾细胞＝1:(5～10)的比例进行混合，1200r·min^-1离心5min。离心结束后，弃卜清液，用SF培养基30mL重悬，1200r·min^-1离心5min，离心后弃上清液(最后一次离心时弃上清液后上清液必须甩干，以免将PEG稀释)。

细胞沉淀用手指轻轻拍散后准备融合，吸取PEG 1mL(37℃预孵育)，逐滴滴加到混合的细胞中，在20s内滴加完成，滴加完成后，轻轻吹吸混匀20s；结束后静置90s。取出孵育的终止液15mL，准备终止反应；用电动移液器和5 mL移液管滴加终止液，先慢后快，于2min内滴加完成，同样边滴加终止液边轻轻晃动离心管混匀，滴加完成后，用移液管轻轻搅动细胞以免细胞沉底。终止反应结束后，1200r·min^-1离心5min，弃上清液。

细胞沉淀用10mL HAT重悬，转移至加有HAT的培养基中，混匀后加入培养皿中，铺板到96孔板中，每孔100uL。铺板后放于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

细胞融合后需将HAT培养基换为HT培养基，换液方式因融合后细胞克隆的长势和数量而略有不同。若集落较大，一个孔细胞总量有几百个细胞(近千个)，5d后换全液HT培养基，吸出180uL，加入200uL HT培养基，2d后筛选；集落稍大(一个孔一二百个细胞)，6d后换全液HT培养基，2d后筛选；集落特别小(一个孔几十个细胞)，5～7d后换半液HAT培养基，吸走100uL、加入120uL，3d后换全液HT培养基，1d后筛选。

相关链接：抗体的制备（二）

文章来源：《环境样品前处理技术》

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