5.3 剂量

5.3.1 剂量设置

受试物至少应取3个检测剂量。对有细胞毒性的受试物,其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性(细胞存活率在20%～100%的范围内)；通常浓度间隔系数不大于。

5.3.2 最高剂量的选择

当收获细胞时,最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数(大于50%,如毒性过大,应适当增加接种细胞数)；同时应该考虑受试物对溶解度、PH和摩尔渗透压浓度的影响；对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物,最高剂量应达到5μL/mL、5mg/mL或10 mmol/L。

对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性,则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下,应使用一个以上可见沉淀的浓度,溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。

5.3.3 细胞毒性的确定

测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标,如相对集落形成率或相对细胞生长率等。应在S9系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。

5.3.4 阳性对照

可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时，可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate,MMS)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate,EMS)、丝裂霉素C(mytomycin C)、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)、硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)等。当存在外源性活化系统时，可使的阳性对照物有苯并［α］茁［benzo(a)Pyrene,BaP］、环磷酰胺(CyClOPhOSPhanlide)等。

不加S9的阳性对照常用丝裂霉素C,其常用浓度为0.2ug/mL～0.8ug/mL。其PH为6～9的水溶液在0℃～5℃下避光保存能存放1周。加S9的阳性对照常用环磷酰胺,其常用浓度为8ug/mL～15ug/mL。其水溶液不稳定，应现配现用。

5.3.5 阴性对照

溶媒应为非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒对照是不含血清的培养液和水,亦可使用二甲基亚砜(DMSO),但浓度不应大于0.5%。

5.3.6 空白对照

如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。

5.4 试验步骤

5.4.1 细胞培养与染毒

试验需在加入和不加入S9(S9的终浓度常为1%～10%,以细胞毒性试验结果为准)的条件下进行。试验前一天,将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中［以收获细胞时,培养皿(瓶)的细胞未长满为标准,一般以长到85%左右为佳;如用CHL细胞,可接种1×10⁶个］,放CO₂培养箱内培养。试验时吸去培养皿(瓶)中的培养液,加入一定浓度的受试物、S9混合液(不加S9混合液时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,置培养箱中处理2h～6h。处理结束后，吸去含受试物的培养液,用PBS溶液洗细胞3次,加入含10%胎牛血清的培养液,放回培养箱，于24h收获细胞。于收获前2h～4h,加入细胞分裂中期阻断剂(如用秋水仙素,终浓度为0.1ug/mL～1ug/mL)。

当受试物为单一化学物质时,如果在上述加入和不加入S9混合液的条件下均获得阴性结果，则需加做长时间处理的试验,即在没有S9混合液的条件下,使受试物与试验系统的接触时间延长至24h。当难以得出明确结论时,应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。

5.4.2 收获细胞与制片

5.4.2.1 消化

用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以800r/min～l000r/min的速度离心5min,弃去上清液。

5.4.2.2 低渗

加入0.075mol/L氯化钾溶液2mL,用滴管将细胞轻轻地混匀,放入37℃细胞培养箱中低渗处理30min～40min。

5.4.2.3 固定

加入2mL固定液，混匀后固定5min以上，以800r/min～l000r/min速度离心5min,弃去上清液。重复一次,弃去上清液。

5.4.2.4 滴片

加入数滴新鲜固定液,混匀。用混悬液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。

5.4.2.5 染色

5%～10%姬姆萨染液，15min～20min。

相关链接：体外哺乳类细胞染色体畸变试验（二）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。