5 试验方法

5.1 受试物

受试物应使用原始样品,若不能使用原始样品,应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。

5.2 实验动物

5.2.1 种、系选择

实验动物的选择应符合GB14922.2和有关规定。啮齿类首选大鼠,非啮齿类首选家兔。若选用其他物种应给出理由。选用健康、性成熟的雄性动物和未经交配的雌性动物,试验开始时动物体重的差异不应超过平均体重的±20%。所用动物应注明种类、品系、性别、体重和周龄。

5.2.2 动物性别和数量

性成熟雄性和雌性动物通常按1：1或1：2比例合笼交配,如果5d内未交配,应更换雄鼠。为了获得足够的胎仔来评价其致畸作用，大鼠每个剂量水平的怀孕动物数不少于16只，家兔每个剂量水平怀孕动物数不少于12只。

5.2.3 动物准备

试验前动物在实验动物房至少应进行3d～5d环境适应和检疫观察。

5.2.4 动物饲养

实验动物饲养条件、饮用水、饲料应分别符合GB14925、GB5749、GB14924.3和有关规定。试验期间动物自由饮水和摄食,妊娠动物应单笼饲养。

5.3 剂量

试验至少设3个剂量组，同时设溶媒对照组，溶媒对照组除不给受试物外，其余处理均同剂量组。必要时设阳性对照组，常用经口给予的阳性对照物及参考剂量为敌枯双(0.5mg/kg体重～1.0mg/kg体重)、五氯酚钠(30mg/kg体重)、阿斯匹林(250mg/kg体重～300mg/kg体重)及维生素A(7500ug/kg体重～13000ug/kg体重视黄醇当量)等,或者用环磷酰胺(15mg/kg体重)于孕第12天腹腔注射1次。曾用阳性物开展过致畸试验、并在所用实验动物种系有阳性结果发现,试验可略去设置阳性对照组。

高剂量组原则上应使部分动物出现某些发育毒性和(或)母体毒性,如体重轻度减轻等,但不至引起死亡或严重疾病,如果母体动物有死亡发生，应不超过母体动物数量的10%。低剂量组不应出现任何观察到的母体毒性或发育毒性作用。建议递减剂量系列的组间距2倍～4倍比较合适。当组间差距较大时(如超过10倍)加设一个试验组。

试验剂量的设计参考急性毒性试验剂量、28天经口毒性试验、90天经口毒性试验剂量和人体实际摄入量进行。对于能求出LD₅₀的受试物,根据LD₅₀值和剂量-反应关系曲线斜率设计高剂量组的剂量。对于求不出LD₅₀的受试物,如果28天或90天经口毒性试验未观察到有害作用，以最大未观察到有害作用剂量作为高剂量;如果28d或90d经口试验观察到有害作用，以最小观察到有害作用剂量(LOA-EL)为高剂量组，以下设2个剂量组。设置剂量水平时还应参考受试物的其他毒理学资料。

5.4 试验步骤和观察指标

5.4.1 “受孕动物"的检查

对于大鼠,雌、雄性动物同笼后,每日早晨对雌鼠检査阴栓或进行阴道涂片检查是否有精子,查出阴栓或精子,认为该动物已交配，当日作为“受孕”零天。对于家兔,雌兔和雄兔合笼后阴道涂片检查到精子当日作为“受孕”零天。将检出的“受孕动物”随机分到各组,并称重和编号。

5.4.2 受试物的给予

受试物通常经口灌胃给予,若选用其他途径应说明理由。通常,在器官形成期给予受试物，(大鼠孕期的第6天～第15天,兔孕期的第6天～第18天)。受试物灌胃给予时,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等)，不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。应每日在同一时间灌胃1次,根据母体体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重,如为水溶液时,最大灌胃体积可达20mL/kg体重；如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重;各组灌胃体积一致。

相关链接：食品安全国家标准—致畸试验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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