六、紫外-可见分光光度法

(一) 简述

紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

1. 波长范围从200～760nm为紫外-可见光区。其中波长范围从200～400nm的电磁辐射为紫外线；400～760nm为可见光。可见光通过色散可得到不同颜色的光(表14-1)。

表14-1 可见光通过色散得到的不同颜色的光

(1) 本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。具有灵敏度高、精度好、操作简便等优点，也是中药成分含量测定常用的一种方法。

(2) 通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量。

(3) 对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若被测物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作为杂质检查。

(4) 物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，对紫外吸收主要决定于分子的外层结构，故紫外光谱又称电子光谱。

(5) 有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色团，均可在紫外区(200～400nm)或可见区(400～850nm)产生吸收。通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190～900nm。

(6) 紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。紫外分光光度法适用于微量和痕量组分析，其测定灵敏度可达10～10g/ml或更低范围。

(7) 中药材中某些化学成分在紫外―可见光区有选择性吸收，显示特征吸收光谱。利用不同药材所含的不同成分，在一定条件下吸收光谱的特征，以鉴别制剂中的化学成分。

(8) 由于中药制剂成分复杂，不同组分的紫外吸收光谱彼此重叠，因此，在测定前，应选择适当的方法将样品提取、净化后再进行测定，以提高方法的专属性。

2. 原理根据朗伯-比尔定律，它是紫外-分光光度法定量分析的依据。

式中，A为吸光度；T为透光度；E为吸光系数；C为溶液浓度；L为光路长度。如溶液的浓度(C)为1%(g/ml)，光路长度(L)为1cm相应的吸光度即为吸光系数以E表示。如溶液的浓度(C)为摩尔浓度(mol/L)，光路长度为1cm时，则相应的吸收系数为摩尔吸收系数，以：表示。

3. 测定法测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.3～0.7之间为宜。仪器的狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带的半高宽度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增大为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液的pH值和对照品溶液的pH值调成一致。

(二) 含量测定

1. 对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液(经处理后)和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液吸光度后，按下式计算供试品溶液中被测溶液的浓度，比较二者吸光度的一致性。

cx=(A_x/A_R)C_R..............(式14-6)

式中，cx为供试品溶液的浓度；Ax为供试品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度；AR为对照品溶液的吸光度。

2. 吸收系数法该法是在被测组分吸收系数(或ε)已知的条件下，按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。

吸光系数E的物理意义：一定波长时，吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。在固定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物理的特征常数。吸光系数愈大，表示该物质的吸光能力愈强。吸光系数可作为定性分析的依据和定量分析灵敏度的估量。因采用不同的浓度单位，E有两种表达方式。

(1) 摩尔吸光系数ε：表示吸光物质的浓度为1mol/L，厚度为1cm时该物质对某波长的吸收能力。ε值是衡量分光光度法分析灵敏度的重要指标。ε一般不超过105。

(2) 比吸光系数：又称百分吸光系数，指在一定波长时，吸光物质溶液的浓度为1%(g/100ml)，厚度为1cm时的吸光度。比吸光系数在药物定量分析中应用很广，《中国药典》均采用比吸光系数。吸收光数通常应大于100。

ε和之间的换算关系：

式中，M为吸光物质的摩尔质量。

注意用本法测定时，并注意对仪器波长、空白吸收、杂散光等及时的校正和验证。

计算公式：

式中，C供为供试品溶液的浓度；A供为供试品溶液的吸光度；ε为吸光系数。

从手册或文献中查出吸光系数ε或，根据供试品溶液测得的A值，求出被测物的浓度。

3. 计算分光光度法计算分光光度法有多种，使用时应按各品种项下规定的方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品的测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。

4. 比色法在可见光区，除某些物质对光有吸收外，供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰，或为了提高灵敏度，可加入适当的显色剂，使反应产物的最大吸收移至可见光区，这种测定方法称为比色法。

比色法除用于单一成分的含量测定，主要用于某一类别成分含量的测定，如鞣质测定法，总黄酮、总皂苷、总生物碱测定等。

用比色法测定时，由于影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的试剂代替对照品或供试品溶液，然后加入等量的相应试剂，并用同样的方法处理。在规定的波长处测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度后，按上述公式计算供试品浓度。

当吸光度和浓度不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。

(三) 注意事项

1. 在建立类别成分的含量测定方法时应注意对照品使用的合理性。一般应选择供试品类别成分中的主成分作为对照。

2. 测定溶液的制备稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。一般平行制备2份供试品溶液，如为对照品比较法，对照品也应称取2份。每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。

3. 除另有规定外应在规定的吸收峰波长±2nm以内再测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长。除另有规定外，吸收峰最大波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度。

4. 一般供试品溶液的吸收度读数应在0.3～0.7之间为宜，吸收度在此范围误差较小。

5. 测定操作应手持吸收池毛玻璃面的两侧。样品溶液的量以池体积的4/5为宜，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂。为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放人的方向相同。使用后用洗涤剂及水冲洗干净，晾干防尘保存。吸收池如污染不易洗净时，可用发烟硫酸-硝酸(3∶1)混合液稍加浸泡后，洗净备用。

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。