3. 荧光分析法

(1) 反应原理：荧光物质分子都具有两个特征光谱，荧光激发光谱和荧光发射光谱。物质受激发后所发射的光，称为发射光或荧光。
荧光分光光度法分为两种，一种是直接荧光法，即某些物质本身能发射荧光，只需将这类物质的样品经适当的前处理分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度；另一种是间接荧光法，大多数有机化合物和绝大多数无机化合物自身不发射荧光，但经过酸或碱处理，或经其他化学方法处理后，这类化合物中有些能发射荧光，可进行间接荧光测定。

(2) 特点：具有灵敏度高，一般要比分光光法大2～3倍；与分光光度法比较，荧光分光光度法在测定时，选择性更强，如酪氨酸和色氨酸的吸收峰相近，但在紫外光照射下，酪氨酸的发射峰在305nm，而色氨酸的发射峰则在348nm；试样用量少，有的在微量池中只需要10ug的样品；能提供较多的物理参数等特点。但也有它的弱点，由于它对环境因素敏感，因此在荧光测定时，干扰因素也比较多，如光分解、氧淬灭、容易污染等。

(3) 注意事项

1) 溶剂及所用玻璃器皿，应高度纯净，注意防止荧光污染。

2) 荧光仪器上所用石英样品池质量要好，应不含荧光性物质，不可与其他仪器混用，使用前后，注意清洗，保持洁净。

3) 荧光仪器在测定时打开光照闸门，读数后应立即关闭光路，以防样品溶液因较长时间光照而导致荧光效率降低及受光检测器光电管的疲劳和老化。

4) 因荧光仪器不同厂牌型号灵敏度存在差异，标准所规定的浓度不一定完全合适，必要时可做试验，找出合适的供试品溶液浓度和仪器测试条件。

5) 如新药供试品溶液激发及发射波长未知时，可按仪器规定方法先预设某-激发波长(如250nm)，扫描记录发射光谱并找出最大波长后，再扫描记录激发光谱，从而确定供试品溶液激发光与发射光波长。

6) 采用由稀到浓几个不同浓度的供试品溶液，进行荧光强度测定，找出其线性浓度范围。

7) 测定时需注意温度、pH和试剂纯度对荧光强度的影响。

(4) 计算公式：

式中，Cx为供试品溶液的浓度；Cr为对照品溶液的浓度；Rx为供试品溶液的荧光强度；Rxb为供试品溶液试剂空白的荧光强度；Rr为对照品溶液的荧光强度；Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度：

因荧光分析法的浓度与荧光强度的线性范围较窄，故比值(Rx-Rxb)/(Rr-Rrb)应为0.5～2.0之内，如有超过，应调解浓度后再测，如线性关系不好应该用工作曲线法。

(5) 结果的判定：荧光分析法一般用于样品的含量、溶出度、含量均匀度等的测定，根据上述计算公式，得到供试品溶液的浓度，判断样品的合格范围。

2 份供试品测定结果，每份结果对平均值的偏差应在±1.5%以内，否则应重做。

(二) 紫外-可见分光光度法(UV)

常用的含量测定方法有：对照品比较法、计算分光光度法、吸收系数法、比色法。

(三) 高效液相色谱法

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。高效液相色谱法按基本分离机制可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法、分子排阻色谱法四大类。

1. 分析原理高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别，使不同溶质得以分离。

2. 计算公式

式中，A供为供试品溶液的峰面积值；A对为对照品溶液的峰面积值；C供为供试品溶液的浓度；C对为对照品溶液的浓度；M供为供试品溶液的进样量(ul)；M对供为对照品溶液的进样量(pl)。

(四) 薄层扫描法

系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查和含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。

1. 测定薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。供试品溶液和对照品溶液应交差点与同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。

2. 计算公式薄层扫描定量分析可采用外标法和内标法，而外标法更为常用。当工作曲线通过坐标原点时，可选用外标一点法定量。即用一个浓度的对照品，同时在薄层板上分别点供试品3～4个和对照品3～4个，测得各自的峰面积，并求出平均值，计算，即得。

m_样/m_标=A_样/A_标..............(式14-13)

式中，m供、m标为供试品和对照品的量；A样、A标为供试品和对照品的峰面积。

当工作曲线不通过原点时，用外标两点法定量。即用高低两个浓度的对照品溶液或一种浓度两种点样量与供试品溶液对比定量。供试品中组分的量为：

m_供=a+bA_供...........(式14-14)

式中，为对照品的两个点样量(或浓度)；A₁、A₂为对照品的峰面积。

式中，A供为供试品溶液的峰面积值；A对为对照品溶液的峰面积值；C供为供试品溶液的浓度；C对为对照品溶液的浓度；M供为供试品溶液的点样量(ul)；M对为对照品溶液的点样量(ul)。

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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