5)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)

HPLC常用于难挥发、强极性物质的分离检测，因其专一性强和灵敏度高，在药物检测中得到广泛的应用。AGs水溶性好、极性大且分子量高，特别适合于采用HPLC法检测。目前，利用液相色谱检测AGs的方法主要有紫外检测法、荧光检测法、电化学检测法、蒸发光散射检测法、化学发光检测等。

A.紫外检测法(ultraviolet detector， UVD)

A.紫外检测法(ultraviolet detector，UVD)

由于AGs没有特征的紫外吸收生色基团，常根据其分子中的活泼基团(如氨基和羰基)与衍生化试剂反应生成有紫外吸收的物质，再采用UVD检测。

董晓庆等采用柱前衍生化、HPLCUVD检测鸡组织中链霉素的残留量。用三氯乙酸沉淀蛋白质，ODS-C18柱净化，1，1-萘醌-4-磺酸钠(NQS)柱前衍生化反应，HPLC-UVD在252nm检测。流动相为乙腈-醋酸盐缓冲液(pH3.3)-水(10+10+80， v/v)，流速0.3mL/min，柱温35℃。在200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL添加浓度，方法回收率分别为75%～90%、70%～86%、64%～75%，CV均小于10%在肌肉、肝脏和肾脏中链霉素的LOD分别为120ug/kg、123 ug/kg和218ug/kg。 Feng等建立了一种快速分析血浆中痕量妥布霉素的HPLC方法。采用1-异硫代氰酸萘基酯(NITC)与血浆中的妥布霉素在70℃衍生化反应，加入甲胺/乙腈溶液消耗掉过量的衍生化试剂，缩短分析时间。衍生物用Purospher STAR RP-18e色谱柱分离，流动相为乙腈-水(50+50，v/v)，UVD在230nm检测。方法线性范围为0.93～9.34mg/L，LOD可达0.23mg/L，回收率超过99%，日内RSD小于2.1%，日间RSD小于5.2%。FenellI等建立了牛奶和动物组织中庆大霉素的HPLC-UVD测定方法。样品用KH₂PO₄-Na₂SO₄溶液(pH8.8)提取，经SPE柱净化后，用邻苯二甲醛(OPA)衍生化，HPLC-UVD在330nm处检测。庆大霉素的4种同分异构体分离良好，出峰位置没有干扰。牛奶和组织中庆大霉素的LOD分别为0.6ug/kg和1ug/kg，CV分别为2.5%和8.1%，回收率超过90%。

B.荧光检测法(fluorescence detector， FLD)

AGs本身不产生荧光，也需要衍生化反应后，才能采用FLD检测。

陈晓红等报道了蜂蜜中链霉素的HPLC-FLD检测方法。采用50%三氯乙酸提取，在C₁₈柱上以0.01mol/L1-庚烷磺酸钠+乙腈为流动相分离，用氢氧化钠和NQS双试剂柱后衍生化，在激发波长263 nm和发射波长447nm下，用FLD检测，获得的回收率为87.9%～93.8%。周萍等建立了蜂王浆中链霉素的残留分析方法。用高氯酸提取，经羧基柱和C₁₈小柱的净化后，HPLC-柱后衍生-FLD检测。流动相为20%乙腈水溶液加1.1g庚烷磺酸钠和0.052g 1，1-茶-4-磺酸钠，用乙酸调pH3.3；色谱柱为Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，4um)；流速1.0mL/min；衍生剂为0.2mol/L NaOH，流速0.4mL/min；柱温50℃，衍生温度50℃；检测波长为λex=263nm，λem=435nm。该方法回收率在74.7%～95.3%之间，方法灵敏度达到了5ug/kg。姜莉等用磷酸溶液提取鲜牛奶中的链霉素，用苯磺酸阳离子交换柱和C₁₈固相萃取柱净化，用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解，HPLC分离，柱后衍生，FLD在激发波长263nm和发射波长435nm测定。方法线性范围为0.01～0.10mg/kg，回收率为78.3%～80.2%，CV为7.4%～12.4%；方法LOD为0.005mg/kg。Edder等开发了肉、奶、蜂蜜等动物源食品中链霉素残留的HPLC测定方法。用高氯酸提取动物源食品中的链霉素，阳离子交换和C₁₈柱固相萃取净化，离子对LC分离，NQS柱后衍生化，FLD测定(激发波长为260nm，发射波长为435nm)。蜂蜜、牛奶、肉、肝和肾中的LOD分别为0.005 mg/kg、0.03mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg和0.1 mg/kg，LOQ分别为0.01mgkg、0.05mg/kg、0.05mg/kg、0.2mg/kg和0.2mg/kg；方法回收率超过80%。
Vinas等采用离子对HPLC分析了食品中链霉素和双氢链霉素残留。该方法采用了一种新型的LC色谱固定相(具有酰胺基团和三甲基硅封端的配体)，有效避免了拖尾。以乙腈-10mmol/L戊磺酸(pH3.3)(6+94， v/v)为流动相，等度洗脱，流速1mL/min；NQS柱后衍生，FLD检测。链霉素和双氢链霉素的LOD分别为7.5ug/kg和15ug/kg。该方法适用于蜂蜜、牛奶、鸡蛋、肝脏等食品基质中链霉素和双氢链霉素的测定。Posyniak等在检测猪肉、肝和肾中庆大霉素和新霉素残留时，提取物经C₁₈固相萃取柱净化后，用9-芴基甲基氯甲酸酯进行柱前衍生化，反相HPLC分离，FLD检测，激发波长为260nm，发射波长为315nm。庆大霉素线性范围在0.1～1.0mg/kg之间，新霉素在0.2～1.0 mg/kg之间；LOD分别为0.05mg/kg和0.10mg/kg，LOQ分别为0.1 mg/kg和0.20mg/kg；回收率分别为76%～86%和77%～83%。

C.电化学法(elctrochemical detector，ECD)

常用的ECD方法是脉冲电化学法(pulse electrochemical detection，PED)，是一种无需衍生化过程可直接检测的方法。PED在色谱分离阶段需在酸性环境下进行，而检测阶段需在高pH环境中，所以一般在柱后加入氢氧化钠等强碱性物质，将流动相调至碱性。官斌等建立了阴离子交换色谱-脉冲安培检测分析牛奶中新霉素残留量的方法。采用三氯乙酸沉淀蛋白，弱阳离子交换固相萃取柱富集净化，分析柱为CarboPac PA10(250mm×4mmi.d.)，流动相为10×10^-3mol/L NaOH溶液，流速0.5mL/min，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgC1，对电极为钛。该方法线性范围为10.0～160.0ng/mL；在10～160 mg/kg添加水平下，回收率为50.3%～76.9%.Braganoski等采用HPLC-PED方法，检测了脑脊髓中的丁胺卡那霉素。方法线性范围在0.06～4.0μg/mL之间，LOQ达0.06ug/mL，回收率接近100%。

D.蒸发光散射法(evaporative light scattering detector， ELSD)

ELSD已被应用于AGs的检测，它与UVD或FLD不同，其响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，且不受其官能团的影响。Megoulas等报道了采用反相HPLC-ELSD检测农产品中卡那霉素A和B的方法。用Spherisorb ODS-2C₁₈柱分离，流动相为水-乙腈(60+40，v/v，含11.6mmol/L七氟丁酸)，流速1mL/min。该方法对于卡那霉素A的线性范围为0.6～28ug/mL，r>0.9998，卡那霉素B的线性范围为4～36ug/mL，r>0.9994它们的LOD分别为0.2ug/mL和1.4ug/mL。

E.化学发光检测(chemiluminescent detector， CLD)

Serrano等采用HPLC-CLD定量检测人血浆和尿液样品中的丁胺卡那霉素。血浆用乙醇/碳酸钠混合溶液稀释后离心，然后将上层清液直接注入HPLC分析。反相色谱柱(C₁₈)分离20min，二价铜离子是发光氨/过氧化氢化学发光系统的催化剂，AGs可以与其发生一系列复杂的反应，因此可以检测AGs。该方法线性范围为0.15～2.0ug/mL；LOD为50ug/L；回收率超过92%，日内、日间RSD均小于9%。

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文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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