(6)高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography， HPLC)

CAPs分子结构中含有一个不游离的氨，为中等极性化合物，可用反相液相色谱法(RP-LC)进行分离。非极性烷基键合相是目前应用最广泛的柱填料，其中十八烷基硅烷键合相在RP-LC分析中发挥着主要作用，一般采用C18分析柱，少数用C₁₈柱或苯基柱。采用的流动相主要有甲醇或乙腈与醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液或水，也有用离子对色谱。CAPs结构中有发色基团，具有紫外吸收，检测时可使用紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)或二极管阵列检测器(photo-diode array， PDA；diode-arraydetector，DAD)。CAP的检测波长可选择214nm、254nm或278nm。在214nm处CAP的检测灵敏度最高，但样品提取液的色谱图上会有许多内源性化合物的干扰峰；而在278nm检测时干扰峰较少。TAP和FF一般在224nm、225nm或230nm进行检测。此外，TAP、FF也有采用荧光检测器(fluorescencedetector，FLD)测定的报道。表4-4列出了部分动物源食品中CAPs残留的HPLC检测方法。

1)UVD和DAD/PDA

Li等建立了猪肉和猪肝中CAP的HPLC-PDA测定方法。猪肉和猪肝的回收率分别为91.3%～94.2%和93.1和103.7%，CV分别为1.4%～4.3%和1.1%～11.2%；LOD为5ng/mL，LOQ为15ng/mL。杨大进等用HPLC-UVD在270nm处检测家畜和鸡肉、肝脏中的CAP。样品用乙酸乙酯超声提取后，再用无水硫酸钠脱水浓缩，加0.5 mol/L高氯酸-正己烷LLP净化，HPLC检测。方法回收率在82.1%～96.6%之间，RSD为5.3%～6.4%。Russel等报道了检测CAP的HPLC方法。用乙腈和硫酸铵提取肌肉中CAP，经正己烷除脂，浓缩后，用HPLC-UVD在254nm检测。方法LOD为10ug/kg，回收率在71%左右。Perez等开发了巴氏杀菌奶中CAP的检测方法。用三氯甲烷-丙酮提取，正己烷LLP净化，HPLC-UVD在275nm测定，用乙酸钠缓冲液和乙腈梯度洗脱。在50 ppb添加水平，方法回收率为104.17%。蒋定国等报道了检测牛奶样品中CAP的方法。先用含有1%高氯酸的乙酸乙酯沉淀蛋白和提取CAP，浓缩后用0.5 mol/L高氯酸溶解，正己烷除脂，HPLC-UVD在278nm处CAP。方法LOD为1.1ug/kg，在20～100ug/kg浓度范围内，平均回收率为88.0%～97.7%。

近年来，国内外对FF残留的研究多是采用Hormazabal等报道的HPLC法。肌肉组织或肝脏，加水、丙酮提取，离心去除下层残渣，上清液加二氯甲烷LLP净化，弃去水层，浓缩至干，加0.01 mol/L磷酸氢二钠(pH2.8)-甲醇(80+20，v/v)复溶，正己烷除脂，下层溶液过滤膜后HPLC-UVD测定。用C18色谱柱分离，流动相为0.02mol/L的庚烷磺酸盐和0.025mol/L磷酸钠(pH3.85)，与0.1%三乙胺甲醇溶液，按照体积比68：32混合，检测波长为220nm。组织中目标化合物标准曲线的绘制用峰高测量法和内标法，TAP作为内标。FF的回收率为99%～107%，在肌肉和肝脏中的检测限分别为20ng/g和50ng/g。该研究在流动相中加入了离子对试剂-庚烷磺酸钠和三乙胺，使该方法具有了分析速度快、分离效率高的特点。Wrzesinski等建立了斑点叉尾鲴肉中FFa的HPLC方法。样品经酸水解、乙酸乙酯提取，SPE净化后，HPLC-UVD测定。在添加浓度0.075～35ug/g范围，方法回收率为85.7%～92.3%，RSD为4.8%～17.2%，LOD为0.044g/g。Vue等报道了鱼血浆中FF的HPLC测定方法。从血浆中提取的药物经C18固相萃取柱纯化后，用配有UVD的RP-HPLC检测。该方法操作简单，取样量较少(250uL)，回收率为84%～104%，精密度不超过8%，LOD达到30μg/L，适合于各种淡水鱼中FF的药代动力学研究。

Nagata 等报道了用HPLC测定肌肉和鱼肉中的TAP、FF和CAP。乙酸乙酯提取，提取液浓缩干燥后，残留物溶于3%氯化钠溶液中，正己烷脱脂，水相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩干燥后用正丁烷溶解，通过Florisil柱净化，ODS柱分离，225nm或270nm紫外检测。该研究发现，乙腈-水作流动相时，溶剂峰会干扰TAP出峰；而甲醇-水作流动相，溶剂峰对TAP和FF出峰都没有干扰。CAP的添加浓度为0.1ug/g时，方法回收率大于74.1%，LOD为0.01ug/g。Wang等用UPLC-UVD测定牛奶中的CAP和TAP，样品中加入20% TCA以沉淀蛋白，然后用Mcllvaine 缓冲液-甲醇(8+2，v/v)提取，HLB净化，纯水淋洗，甲醇洗脱，乙腈-10mmol/L乙酸作为流动相，C18色谱分离。方法回收率为52.1%～89.6%，RSD为5.7%～14.3%，LOD为4～7ug/kg。占春瑞等用乙酸乙酯提取水产品中的TAP和FF，正己烷除脂后，HLB净化，10%甲醇淋洗，甲醇洗脱，10%乙腈复溶上样，UPLC-DAD检测。方法LOD分别为10ug/kg(TAP)和5ugkg(FF)，回收率在80%～95.8%之间。

2)FLD

Xie等用RP-LC-FLD检测鸡蛋中的TAP、FF和FFa。用1mL乙腈-水(30+70，v/v)和20 mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49+49+2，v/v)超声提取5min后，氮气吹干，乙腈复溶，正己烷脱脂，C18色谱柱分离，HPLC-FLD检测。激发波长为224nm，发射波长为290nm。方法LOD为1.5ug/kg(TAP、FF)，0.5ug/kg(FFa)，LOQ为5ug/kg(TAP、FF)，2ug/kg(FFa)；回收率为86.4%～93.8%(TAP)、87.4%～92.3%(FF)、89.0%～95.2%(FFa)，日内和日间RSD分别小于6.7%和10.8%。

而CAP结构中含有芳香族硝基，可以用荧光胺进行衍生化，加上氨基产生荧光，用FLD检测。潘莹宇等建立了对牛奶中CAP的残留量进行检测的HPLC-FLD检测方法。CAP还原后在温和条件下与荧光胺发生衍生化反应，采用C18色谱柱，以乙腈、四氢呋喃、0.02 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液(pH 6.0) (16+8+76， v/v) 为流动相，流速1.0 mL/min，柱温40℃，荧光检测激发波长为410nm，发射波长为508 nm。CAP检测的线性范围为0.4～800 μg/L，LOD为0.2 μg/L。当空白样品中CAP添加水平为2～40 μg/L时，方法回收率为66.6%～92.8%，RSD 为4.5%～9.4%。

表4-4 部分动物源食 品中CAPs残留的HPLC检测方法

相关链接：氯霉素类药残留测定——薄层色谱法和毛细管电泳法

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。