8.2.5.1 适用范围

适用于牛尿中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的高效液相色谱-串联质谱测定。方法检出限均为2μg/L。

8.2.5.2 方法原理

试样在pH=5.0条件下加酶水解，经免疫亲和柱净化，用高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。方法检出限：牛尿中a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮均为2μg/L。

8.2.5.3 试剂和材料

甲醇、乙腈、乙酸：色谱纯；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯(B-glucuronidase/aryl sulfatase)：100000unit/mL。

氢氧化钠溶液：1mol/L。10g氢氧化钠溶于250mL水中。

盐酸溶液：1mol/L。吸取20.8mL浓盐酸溶于水中，定容至250mL。

免疫亲和柱淋洗缓冲储备液和柱储存缓冲储备液：免疫亲和柱附带。

柱淋洗缓冲溶液：量取1mL储备溶液与19mL水混溶，临用前现配。

柱储存缓冲溶液：量取1mL储备溶液与4mL水混溶，临用前现配。甲醇+水溶液(70+30，v/v)。

a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质：纯度≥98%。

标准储备溶液：分别精确称取a-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质各0.0100g，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的标准储备溶液。此溶液-18℃冷冻保存，可使用6个月。

混合标准工作溶液：取标准储备溶液各5mL至50mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成混合标准工作溶液，浓度为10μg/mL，此溶液-18℃冷冻保存，可使用三个月。

群勃龙/19-乙烯去甲睾酮免疫亲和柱：带有柱淋洗缓冲储备溶液和柱储存缓冲储备溶液，在2～8℃保存。

8.2.5.4 仪器和设备

高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。离心机：最大转速5000r/min。恒温水浴摇床。旋涡混合器。氮气浓缩仪。固相萃取装置。

8.2.5.5 样品前处理

(1)试样制备

取新鲜牛尿迅速冷冻作为试样备用。制备好的试样置于-18℃冰柜中避光保存。

(2)试样称取

取5个阴性样品，将冷冻尿液融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，每个样品分别量取5mL(精确到0.01mL)于15mL具塞离心管中，再分别加入不同量混合标准工作溶液，使各被测组分的浓度均为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

(3)水解

分别将上述离心管溶液，用1mol/L的盐酸调节尿样pH在4.9～5.1之间，接着加入40μL β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯，摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床上37℃振荡水解2h。待水解液冷却至室温后，加入4mL柱淋洗缓冲溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调整尿样pH在7～9之间。

(4) 免疫亲和柱净化.

首先将柱中储存缓冲溶液过柱，再用15mL柱淋洗缓冲溶液平衡柱子。然后，将水解处理好的尿样过柱，接着依次用8mL柱淋洗缓冲溶液、5mL水淋洗柱子。最后，用4mL甲醇+水溶液洗脱分析物并收集于带刻度的试管中(.上述过程过柱流速应≤2mL/min)。洗脱液用氮气浓缩仪在60℃水浴中吹至约1mL，用流动相定容至2mL，漩涡振荡混合，过0.45μm滤膜供HPLC-MS-MS测定。

(5)试样溶液的制备

将冷冻尿液样品融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，量取5mL(精确到0.01mL)于15mL具塞离心管中。按上述步骤操作。

(6)空白基质溶液的制备

将阴性冷冻尿液样品融化混匀，取部分样品以转速4000r/min离心10min。然后，量取5mL(精确到0.01mL)于15mL具塞离心管中。按上述步骤操作。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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