(2)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，免疫分析技术最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。TCs残留分析主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)和放射免疫分析法(RIA)。

1)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是可以对大批样本进行定性、定量测定的方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速的特点。

Jeon等采用生物素与亲和素介导的竞争性ELISA分析牛奶中的TC将TC与卵清蛋白偶联制备羊抗TC多克隆抗体，结果LOD为0.048ug/L。使用该法处理的样品无需净化和稀释，结果灵敏度高，并且所测的几种物质未发现交叉反应。Zhang等合成三种新的免疫源制备兔抗TC多克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)，添加回收率为74%～116%，新免疫原的合成可为牛奶中TCs残留检测提供新的筛选方法。Lee等采用半定量ELISA测定猪血浆中的OTC、CTC和TC含量。

Pastor-Navarro等合成TCs的酰胺和重氮衍生物选择性半抗原，制备多克隆抗体，筛选蜂蜜中残留TCs，LOD为0.4ng/mL，回收率达到79%～108%。该法提供了一步合成半抗原的新途径，但物质的交叉反应均超过10%。Jeon等报道了基于生物素抗生物素介导的ELISA方法，测定蜂蜜中的TC。用pH7.2的PBS-EDTA测定缓冲液配置和稀释TC标准品，不需要任何前处理，直接ELISA测定。方法LOD为0.19μg/L，LoQ为0.38μg/L，回收率为95%～101%，与结构相似物没有发现交叉反应。

Le等基于金霉素-牛血清白蛋白(CTC-BSA)作为免疫原产生的单克隆抗体建立了快速、灵敏测定动物组织中CTC残留的ELISA方法。改进的ELISA方法中半数抑制浓度(IC₅₀)为0.66ng/mL。鸡肉和鸡肝中CTC的添加回收率范围分别为78.8%～92.2%和80.3%～90.2%，CV分别为3.2%～9.5%和6.5%～10.2%；LOD分别为0.06ng/g和0.07ng/g。该作者还应用高灵敏度和特异性单克隆抗体建立了改进的ic-ELISA测定鸡肉和鸡蛋中DC残留。应用杂交瘤技术制备DC单克隆抗体，测定灵敏度、特异性，精密度和准确度等参数对改进的ic-ELISA方法进行了评价。在最佳实验条件下，在0.01～100ng/mL范围内绘制标准曲线，IC₅₀值为(1.32±0.18)ng/mL，LOD为(0.14±0.02)ng/g；添加水平为50～600ng/g时，鸡肝、鸡肉和鸡蛋中DC的回收率分别为84.6%～85.5%、88.2%～89.1%和84.4%～～89.3%，CV分别为5.1%～9.3%、3.7%～11.3%和4.7%～9.8%。

2)胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA因其快速、简便、灵敏度高的优点成为近几年用于牛奶、鸡蛋中TCs残留检测的新方法。

檀尊社等建立了快速检测水产品中TCs残留的GICA方法。采用竞争模式，将抗TC单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，并将人工合成的TC抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线，残留药物与待测样品中TC竞争结合胶体金标记的TC单克隆抗体，以颜色直观显示检测结果。试剂灵敏度最低值可达100ng/mL，仅需5～10min，与CTC、OTC、DC等TCs有很强的交叉反应，而与沙丁胺醇、莱克多巴胺等其他兽药无交叉反应。方莹等也建立了快速检测TC残留的GICA方法。将制备的胶体金颗粒与抗TC单克隆抗体结合形成抗TC单克隆抗体金标复合物标记在胶体金结合垫上。并将TC人工抗原包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，待测样品中相应TCs竞争结合胶体金标记的抗TCs单克隆抗体，以颜色直观显示检测的定性结果。检测肉类样品，灵敏度最低值可达到10ng/mL，只需3～5min，与其他兽药无交叉反应。Le等建立了一种利用胶体金标记单克隆抗体一步侧流免疫层析技术快速检测猪组织中DC残留的方法。为了进行测定，引入了一个对其他TCs具有较低交叉反应的DC胶体金标记单克隆抗体，命名为2.3/3A6。测试带对DC的灵敏度低达7ng/mL，IC₅₀为(22±2)ng/mL。该测试可在10min内完成，裸眼视觉评估LOD为20ng/mL；在20ng/g、40ng/g和80ng/g三个水平，添加回收率分别为81%～95%(肌肉)、81%～92%(肝脏)，日内和日间CV分别为3%～6%和4%～8%。

3)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是一种应用放射性同位素的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合而成的体外微量分析方法，原理使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。

Meyer等将一种商业化的适用于血液、尿液、牛奶和组织中TCs分析的RIA方法，改进用于水样中TCs的分析，方法LOD约为1.0ppb，半定量水平为1～20ppb。检测结果通过了液相色谱-质谱(LC-MS)的确证。

相关链接：四环素类药物残留分析技术——测定微生物法

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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