(5)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

与GC相比，HPLC不受待测物的极性、热稳定性、挥发性等的限制，可同时检测更多的种类，大量文献采用HPLC检测各种基质中的硝基咪唑类药物。HPLC主要配以紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)或二极管阵列检测器(diode- array detector，DAD；photo-diode array detector，PDA)，硝基咪唑类药物最大吸收波长在301～312nm之间，紫外检测波长越大，杂质干扰就越少，因此一般设在300nm以上，多数为320nm。色谱分离主要采用反相色谱，流动相由弱极性有机溶剂如乙腈或甲醇，与弱酸性溶液如甲酸、乙酸或磷酸等组成。硝基咪唑类药物属两性或碱性化合物，较高pH可明显增加其分离效果和保留时间。Sun等发现低含量乙腈可以有效分离极性药物如MNZOH、RNZ和MNZ，而高含量乙腈可以快速有效洗脱低极性药物ORZ；同时，甲醇可以改善峰形和缩短分析时间。因此，合适甲醇和乙腈比例可以优化分离和峰形。流动相多采用乙腈、甲醇、缓冲液或水等度或梯度洗脱。

Zhou等用C₁₈反相色谱分离，流动相为乙腈-0.01mol/L乙酸钠缓冲液(9+91，v/v)，流速0.8mL/min，315nm波长检测蜂蜜中5种硝基咪唑类药物(MNZ、DMZ、RNZ、TNZ和HMMNI)。方法LOD为1.0～2.0μg/kg，平均回收率为71.5%～101.4%。Huang等应用HPLC同时测定蜂蜜中MNZ、RNZ、DMZ和TNZ。色谱柱为Thermo LC-18(250mm×4.6mmi.d，5μm)，流动相为乙腈-10mmol/L乙酸钠缓冲液(用乙酸调节pH6.5)(15+85，v/v)，检测波长320nm，流速1.0mL/min，进样体积20μL。方法LOD和LOQ分别为0.47～1.52μg/kg和1.54～5.0μg/kg，回收率为71.1%～114%。高小龙测定蜂蜜和蜂王浆中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ残留，采用Hypersli ODS2色谱柱，流动相为水-乙腈(90+10，v/v)，流速1mL/min，320nm紫外检测。蜂蜜和蜂王浆中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均为1.0μg/kg，回收率分别为59.2%～70.6%和54.9%～69.1%，CV分别小于18%和16%。

Sams等应用HPLC-UVD测定禽蛋和猪肉中的3种硝基咪唑药物。色谱柱为Genesis C18 column(250×3.0mm，4mmid.)，流动相为pH4的0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(90+10，v/v)，检测波长320nm。方法LOD均为0.5μg/kg；回收率分别为75%(DMZ)，77%(RNZ)和81%(MNZOH)；CV分别为16.4%、11.3%和14.0%。高小龙建立了HPLC测定鸡组织中DMZ和DMZOH的方法。用Hypersli ODS2色谱柱分离，流动相为水-甲醇(86+14，v/v)，320nm紫外检测。DMZ及DMZOH的LOQ均为1.0μg/kg；肌肉平均回收率在56.9%～76.5%之间，肝脏在63.3%～72.6%之间，肾脏在64.2%～73.3%之间，脂肪在63.5%～75.7%；日内CV均小于16%，日间CV均小于15%。王扬等采用HPLC-UVD测定了鱼肌肉中MNZ、DMZ、ORZ、TNZ和RNZ残留。应用C18色谱柱分离，以醋酸铵缓冲液-乙腈(86+14，v/v)为流动相，320nm紫外检测。5种硝基咪唑类药物的LOD均为1.0μg/kg；罗非鱼中MNZ、DMZ、ORZ、TNZ及RNZ的回收率分别为73.3%、74.7%、62.9%、74.4%、80.1%；测定RSD不大于10%。Sorensen等测定鱼肉中MNZ和MNZOH残留，用反相C18色谱柱分离，流动相分别为乙腈～甲醇-pH3.0磷酸溶液(3+9+88，v/v)和乙腈-pH3.0磷酸溶液(8+2，v/v)，梯度洗脱，紫外325nm波长检测。MNZ的LOD为3μg/kg，MNZOH为5μg/kg；MNZ平均绝对回收率为81%～93%，MNZOH为79%；CV分别为3.3%和3.2%。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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