(7)免疫分析法(immuno analysis，IA)

免疫学检测方法是基于抗原_抗体反应原理设计的测定药物残留的分析方法。免疫分析不需要复杂仪器设备，降低了检测成本，且灵敏度高，操作简便快速。目前，硝基咪唑类药物残留分析中采用较多的免疫方法主要有酶联免疫分析方法和免疫传感器方法。

1)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性，让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。

MNZ是一种小分子，本身并不具备免疫原性，必须将其与具有免疫原性的载体蛋白相偶联生成完全抗原才具有免疫原性。由于MNZ本身没有氨基、羟基或羧基等活性基团，需要进行结构改造。Wang等测定动物源食品中硝基咪唑类药物，首先在碱性条件下将RNZ的2位酯键水解生成MNZOH，MNZOH与戊二醛合成MNZ半抗原，分别采用混合酸酐法将半抗原与小牛血清蛋白(BSA)反应生成包被抗原，用碳二亚胺法(EDC)将半抗原与血蓝蛋白反应生成免疫抗原，获得了硝基咪唑类药物的单克隆抗体，用间接显色ELISA法检测硝基咪唑抗体。方法的IC₅₀分别为0.20ng/mL(MNZ)、4.0ng/mL(TNZ)、0.17ng/mL(DMZ)和0.24ng/mL(ORZ)，与MNZ、TNZ、DMZ、RNZ、ORZ和SNZ的交叉反应率分别为100%、5%、121%、82%、16%和20%，与其他结构或功能相似的药物交叉率很小。在食品中的LOD为0.1ng/mL，检测鸡肉、鸡肝和虾肉中硝基咪唑类药物的回收率为74.0%～90.6%，CV小于14%。

也可以将硝基还原为氨基后再与蛋白偶联。Huet等用水合肼法将MNZ硝基还原成氨基，再用EDC法合成抗原，以避免载体蛋白自身的氨基和羧基在交联剂作用下发生自身交联，从而最大限度地减少反应副产物的生成。免疫过程中，在合成抗原的诱导下，机体产生针对载体BSA决定簇和半抗原决定簇的抗体。以此建立了检测禽蛋和鸡肉中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ以及MNZOH等5种硝基咪唑类药物的ELISA法。样品用乙腈萃取，正己烷除脂后，ELISA检测。不同药物回收率在18%～98%之间；蛋和鸡肉中DMZ的LOD分别小于1μg/kg和2μg/kg，MNZ的LOD小于10μg/kg，RNZ和HMMNI的LOD均小于20μg/kg，而IPZ的LOD小于40μg/kg。

2)免疫传感器(bioimmunosensor)

免疫传感器由偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，将抗原抗体特异性免疫反应信号转化为其他信号再进行检测。硝基咪唑类药物检测主要采用光学免疫传感器，光学免疫传感器使用光敏元件作为信息转换器。将涂有抗体的光纤浸入溶液中来检测溶液里的抗原，溶液中抗原与抗体结合，再将结合了抗体的光纤浸入含有被荧光标记的抗原溶液里，带有荧光指示剂的抗原会与竞争抗体结合，在光纤的另一端加上光源，将返回一个荧光信号。待测试抗体的浓度越高，就有更多的荧光标记抗原与其结合，返回的荧光信号就越强。Thompson等研制了检测动物肝脏、肾脏、禽蛋、牛奶和血清中硝基咪唑类药物的光纤免疫传感器。通过免疫绵羊MNZ蛋白结合物获取多克隆抗体，交叉反应表明所获得的多克隆抗体可以结合至少7种主要硝基咪唑及其代谢物(包括RNZ、IPZ、MNZ、MNZOH、HMMNI和IPZOH)，样品用乙腈提取离心后直接测定。DMZ的CCβ小于1μg/kg或mg/L。Connolly等也利用硝基咪唑多克隆抗体，制备了可同时测定禽肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的光纤生物传感器。DMZ、MNZ和RNZ的CCβ小于1ppb，另外两种代谢物的CCβ小于2ppb。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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