乳房炎病原菌分离鉴定需在具备超净工作台和生化培养箱的实验室进行。患牛乳头酒精消毒后，弃3把奶，然后采集奶样约3ml于无菌试管中，送实验室检测。

每个奶样分别接种营养琼脂、麦康凯琼脂和血琼脂平板，置37℃培养箱中培养18-24小时。挑取菌落涂片固定，革兰氏染色镜检，大体确定是肠杆菌属还是葡萄球菌、链球菌属，触酶试验区分葡萄球菌和链球菌。挑取营养琼脂、血琼脂平板上的菌落，接种营养琼脂、血琼脂平板，进一步增菌、纯化培养。

纯化后的细菌可接种细菌微量生化鉴定管（肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属等），按照产酸产气的不同，确定细菌种属。也可以在细菌纯化后采用API等细菌鉴定系统进行鉴定，更为快速、准确。