一、目的和要求

(1)了解荧光光度计的原理。

(2）掌握荧光分光光度计的操作方法。

(3）学会用荧光法测定水中不同价态硒的含量。

二、原理

硒是人体及动植物生长所必需的微量元素，但过量的硒能引起中毒，如脱发、脱指甲等；而硒的缺乏则会导致生病。硒的测定方法很多，常用的有二氨基萘荧光法，该法选择性好、灵敏度高、操作简便、准确，能测定总硒、+ 6价硒、十4价硒及十4价以下的无机硒和有机硒含量，最低检测限为0. 005μg（硒）。

在pH为1.5-2.0溶液中，2,3-二氨基茶选择性地与＋4价硒离子反应，生成4,5-苯并苤脑绿色荧光物质，用环己烷萃取，其荧光强度与Se4+含量成正比，可定量测定硒含量。

水样不经消解直接测定出的硒为Se4+；水样经混合酸消解后，可将十4价以下的无机硒化物和有机硒化物氧化至Se4+，故测出的硒含量为＋4价及低于十4价硒的总量；若再加盐酸继续消解，则可将Se6+还原成Se4+，测出来的为总硒。

三、仪器与试剂

(1) 荧光分光光度计。

(2) 25mL及250mL分液漏斗（活塞勿涂油）。

(3）电热板。

(4）水浴锅。

(5) 100mL具塞瓶。

(6) 5mL比色管。

(7) 硒标准储备溶液。称取0. 1000g金属硒（Se),溶于少量浓硝酸中，加入2mL高氯酸，在沸水浴上加热蒸去硝酸（(3-4h)，稍冷后加入约l0mL纯水及8. 4mL浓盐酸，继续加热2min，然后定容至1000mL。此溶液1. 00mL含100. 0μg硒，储于冰箱内备用。

(8）硒标准溶液。取一定量的硒标准储备溶液，用0. lmol/L盐酸稀释，此溶液1. 00mL含0. 050μg硒，于冰箱内保存。

(9) 硝酸一高氯酸溶液（1:1)。硝酸与高氯酸均为优级纯。

(10）盐酸溶液（l:4)。盐酸为优级纯。

(11) 氨水（1:1)。

(12) 0.02％甲酚红指示剂溶液。

(13) 混合试剂Ⅱ。称取l0g乙二胺四乙酸二钠于少量纯水中，加热溶解。冷却后，加入l0g盐酸羟胺，搅拌至溶解，加入l0mL 0. 02％甲酚红指示剂溶液，用纯水稀释至200mL。

(14) 混合试剂n。用纯水将混合试剂工稀释10倍。

(15）精密pH试纸。pH=0. 5-5. 0。

(16) 0.1% 2, 3-二氨基萘溶液（此溶液需在暗室中配制）。称取l00mg2,3-二氨基萘[C₁₀H₈ (NH₂ )₂ , DAN]，置于250mL磨口锥形瓶中，加入l00mL0. lmol/L盐酸，振摇至全部溶解（约15min后）。加入20mL环己烷，继续振摇5min，移入底部塞有玻璃棉（或脱脂棉）的分液漏斗中，静置分层后将水相放回原锥形瓶内，再用环己烷萃取多次（一般需5-6次），直到环己烷相的荧光强度最低为止，弃去环己烷相。将此纯化的水溶液储于棕色瓶中，加一层约l cm厚的环己烷以隔绝空气，于冰箱内保存。使用前再用环己烷萃取一次。经常使用以每月配制一次为宜，不经常使用可保存一年。

(17）环己烷。不得有荧光杂质，不纯时需重蒸后使用，用过的环己烷重蒸后可再用。

四、实验步骤

1．总硒

(1）消解。吸取5.0-20. 0mL水样（含0.005-0. 05μg硒）及硒标准溶液(0. 05μg/mL) 0mL、0. 10mL、0.30mL、0. 50mL、0. 70mL及1. 00mL分别于100mL磨口锥形瓶中，加纯水至与水样相同体积。沿瓶壁加入2. 5mL硝酸一高氯酸（(1：1)，摇匀。将锥形瓶（勿盖塞）置于电热板上加热至瓶内产生浓厚的白烟，溶液由无色变为浅黄色（瓶内溶液太少时，颜色变化不明显，以观察浓厚白烟为准）即到终点，立即取下（注意：如消解未到终点而过早取下，会因荧光杂质未被分解而产生干扰，使测定结果偏高；但到达终点还继续加热，将会造成硒的损失）。稍冷后加入2. 5mL）盐酸（1:4)溶液，继续加热至终点。

(2) 消解完毕的溶液放冷后，各瓶均加入l0mL混合试剂II，摇匀，溶液呈桃红色，再用氨水（1：1)调至浅橙色。若加过量氨水，溶液呈黄色或桃红（微带蓝）色，需用盐酸（1：4）再调至浅橙色。此时溶液pH=1.5-2.0，必要时需用pH=0.5-5.0的精密试纸检验。

(3) 在暗室内黄色灯光下，向上述各瓶内加入2mL 0. 1% DAN溶液，摇匀，置沸水浴中加热5min后取出，冷却。向各瓶加入4. 00mL环己烷，加塞盖严，振摇2min，全部溶液移入分液漏斗中，待分层后，放掉水相，将环己烷相由分液漏斗上口（先用滤纸擦干净）倾入具塞试管内，盖严待测。

(4) 荧光测定。用荧光分光光度计（激发光波长为376nm，发射光波长为520nm）或用荧光光度计[如930型，其激光滤片为330nm，荧光滤片长为510nm（截止型）和530nm（带通型）组合滤片] 测定荧光强度。

(5) 绘制标准曲线，从曲线上查出水样中总硒含量。

2. +4价无机硒

吸取20-50mL水样（含0.005-0. 05μg硒）及硒标准溶液（0. 05μg/mL)0mL、0. L0mL、0. 30mL、0. 50mL、0. 70mL及1. 00mL于磨口三角瓶中，加纯水至与水样相同体积。加入1mL混合试剂I，溶液呈浅黄色，加盐酸数滴，调至浅橙色。以下步骤同总硒测定。

3. +4价以下的无机硒或有机硒

操作步骤除水样消解至终点时不加盐酸外，其余步骤同总硒测定。

五、数据处理

总硒、+4价无机硒、+4价及＋4价以下的无机硒和有机硒的浓度均按以下公式计算：

c (μg/mL）=M/V

式中：c——水样中所测价态硒浓度，μg/mL;

M——从曲线上查得水样中所测价态硒含量，μg;

V——水样体积，mL。

六、注意事项

(1) 本法样品预处理操作很重要。样品以硝酸一高氯酸消解不完全时杂质荧光最高，若消解时间过长，硒损失很大。所以消解快到终点时，需要注意观察浓厚白烟的变化，不要过多摇动瓶，当瓶内白烟分层滚动时，即到终点，应立即取下。

(2) 硒与2,3一氨基萘必须在酸性溶液中反应，pH以1.5-2.0为最佳，pH过低时溶液易乳化，太高时侧定结果偏高。甲粉红指示剂有pH=2-3及pH=7.2-8.8两个变色范围，前者是由桃红色变为黄色，后者是由黄色变为桃红（微带蓝）色。注意不要弄错，必要时可用精密pH试纸（pH=0. 5一5.0)检查，确保溶液pH为1.5-2.0。

（3）样品与标准曲线系列必须同时进行分析。