免疫荧光双染

(1) 冰冻切片用0. 0l mol/L PBST（或PBS)漂洗或冲洗3次，每次5 min。

(2) 3% H202孵育l 0min，再用0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。

(3) 5％-8％的正常动物血清（山羊或马血清）孵育30-60min。

(4）洗掉血清，滴加两种不同源性的一抗（0. 0l mol/L PBS配制），4℃过夜。

(5）吸出一抗，0. 0l mol/L PBS冲洗3次，每次5 min，加入不同荧光标记的不同源性的二抗（0. 0l mol/L PBS配制），4℃过夜。

(6）吸出二抗，0. 0l mol/L PBS冲洗3次，每次l 0min。

(7）封片剂封片，荧光显微镜观察照相。典型的实验结果见图20.3。

注意事项：

(1) 两种一抗来自不同的动物，如鼠和兔，两种二抗相对应的也为鼠源性或兔源性的。一抗和二抗的浓度要提前做荧光单标，来确定最佳浓度。

(2) 如果两种一抗为同一源性，则首先加入荧光标记较强的一抗，4℃过夜，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min，而后加入相应的二抗，4℃过夜，0. 01 mol/L PBS冲洗3次，每次1 0min。加入血清第二次封闭30-60min，进行第二种抗体的标记。为避免交叉标记，可在第二次血清封闭时同时用甲醛熏蒸。