一、原代培养

原代培养，也称原代细胞培养，是指将动物机体中待培养组织从机体中取出，然后用各种消化酶消化，如胰蛋白酶消化，或用机械方法处理，将组织分离成单细胞，最后添加适当的培养液培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的整个操作过程。

原代培养的细胞由于其和机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近，常被用作药理实验重要的研究材料。此外，原代培养还用于细胞系建立、细胞分化研究、病毒培养制备病毒疫苗等目的。

需要根据组织来源的差异，选择合适的基础培养液和血清等添加物的含量。通常使用培养方瓶进行原代培养，也可以使用培养皿和6孔、24孔细胞培养板进行培养。

原代培养分为消化法培养和组织块培养。消化法培养，是指从供体组织制备成单细胞悬液后在体外进行的培养。组织块培养，也称组织培养，是将直接培养供体来源的组织小块进行体外培养。

二、传代培养

当细胞培养物长成致密的单层后，通常已经没有足够的生长空间和营养条件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长，同时使细胞的数量扩大，就必须进行传代再培养。同时，传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞传代方法相对简单，而贴壁细胞则需经消化制备细胞悬液后才能传代培养。

将密度在104-105/ml范围的细胞悬液接入培养板（24孔板、6孔板）的培养孔或培养方瓶（25cm2、75cm2）内培养。当密度接近106/ml，或孔底、瓶底表面接近长满单层细胞时，添加适量新鲜培养液到新的培养孔（24孔板为1.5ml/孔、6孔板为3m1/孔）或培养方瓶(25cm2为6-15ml／瓶、75cm2为10-40ml／瓶）。取新的无菌长丝滴管，套上胶头后，从待传代的生长孔中混悬细胞使成单细胞悬液，移取细胞悬液到新的培养孔或培养方瓶，混匀，使接种的细胞密度保持在104-105/ml范围，继续放入CO2培养箱培养。

动物的传代细胞，它们的细胞周期即分裂间隔一般在23h左右。因此，合理的传代间隔是3-4d。传代操作应充分遵照无菌操作规范，使用无菌器材。

三、扩大培养

扩大培养指通过扩大培养体系提供更大的培养空间，同时补充新鲜培养液，使细胞不断增殖，以便获得足够数量的细胞的操作过程。扩大培养是动物细胞大量培养的技术基础，与大量培养不同。扩大培养的目标细胞总数一般在108以内，大量培养的目标细胞总数是越多越好。通常大量培养以维持最大生长密度的时间计算，追求的是高浓度的细胞代谢产物或最大细胞代谢产物的产量。

一般在细胞复苏后进行的细胞培养、原代细胞的后续培养、克隆化细胞培养的后续培养等，均属于扩大培养。在大量培养过程中，此时的扩大培养也称种子细胞培养。

扩大培养有时是从传代培养的细胞培养物中进行扩大培养。为了某种实验目的，如用于原代细胞药理试验或传代细胞的细胞药理试验，准备足量的细胞数的过程，就要进行细胞扩大培养。

（一）培养体系

动物细胞扩大培养的方法可分为两种：①悬浮培养，细胞能在液体培养液中悬浮生长。悬浮培养体系可以是6孔细胞培养板、培养皿或培养方瓶。②大多数动物细胞需要附着在一定的固定表面上才能增殖，因此称单层培养。单层培养的突出问题是提供细胞生长所需的表面积和组织培养处理（TC处理）的生长基底。培养体系与悬浮培养的主要区别是有无TC处理，优选使用TC处理的6孔细胞培养板、培养皿或培养方瓶。

（二）培养流程

动物细胞扩大培养的流程，常见的有如下手法：

1．克隆化培养细胞的扩大培养

96孔板→24孔板→6孔板→培养皿或25cm2方瓶→75cm2方瓶。

2．传代细胞的扩大培养

(1)当使用24孔培养板传代时，扩大路径是24孔板→6孔板→培养皿或→75cm2方瓶。

24孔板的1个培养孔全部细胞转移到6孔板的1个培养孔中培养。经历3-5d,6孔板的1个培养孔中到达生长密度极限的全部细胞再转移到1个25cm2方瓶继续培养。经历3-5d的传代间隔期，可以全部转移到75cm2方瓶培养，或分别接种于2-4个25cm2方瓶培养。其中，随着培养体系的扩大，需要补充相应体积的新鲜培养液。

(2)使用6孔培养板传代时，扩大路径是6孔板→培养皿或25cm2方瓶→75cm，方瓶。

(3）使用25cm2方瓶传代时的扩大路径则是25cm2方瓶→75cm，方瓶。

（三）细胞收获

用单层培养方法培养的贴壁细胞从附着的载体上剥离下来，常用胰蛋白酶消化，或用鳌合剂赘合细胞使细胞脱离载体，或用刮、擦、拉等机械力使细胞从载体上脱落的方法。以上几种方法可以结合使用。

扩大培养后，悬浮细胞的收集比较简单，用震荡、长丝滴管吹吸等手法，就可使全部细胞悬浮。

收集的细胞悬液，需要经过离心使原培养液与细胞沉淀分离。

分离原培养液后，用弹指法分散沉淀，追加新鲜培养液后制备细胞悬液，用于扩大培养或其他实验目的。

四、克隆化培养

哺乳动物细胞克隆化培养即单细胞培养技术，是维持单一细胞类型及其特性的有效方法。

原代细胞做克隆化培养的成功率最低，也往往没有必要。因为原代细胞只能存活有限的几代，当克隆化培养的后续扩大培养达到所需细胞总数时，这些细胞也许已经接近衰老。有限细胞系和无限细胞系，即细胞株和细胞系，进行克隆化培养的成功率比较高，尤其无限细胞系的克隆化。

（一）克隆化培养的意义

1.混杂细胞的分离纯化

适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞培养常用的、重要的基本技术之一。

杂交瘤细胞建株过程中，克隆化培养是非常必要的环节和手段，能够及时确定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰由于发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌的阴性细胞株。一般杂交瘤细胞需经过2-3次反复克隆后，才能达到100细胞阳性率。

2．培养细胞存活能力测试

克隆化培养可测试不同培养条件对细胞存活能力的影响。用于优化细胞生长条件、测试细胞的化学敏感性和放射敏感性等。如牛血清的筛选中，选择克隆形成率高的血清批号用于日常细胞培养。

（二）克隆化培养方法

1．有限稀释法克隆培养

通过有限稀释，使细胞密度低至一定程度再接种培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成单独的细胞克隆。细胞克隆是指1个细胞来源，经过细胞分裂形成独立的细胞集落。

此法进行的克隆化培养，建议使用平底％孔细胞培养板。接种密度控制在10-200个／ml。在计数准确，细胞活性正常的情况下，一般稀释为20个／ml，每孔接种200μl，这样每孔落入细胞数平均为1，获得单克隆生长孔的概率最大，数量最多。

有些细胞的克隆化培养效果不理想的原因与它们在低密度下没有能力生存有关。要使细胞在克隆化培养环境下低密度目标细胞能正常生存，可以模拟高细胞密度的环境，就是让目标细胞在含饲养细胞的培养体系中培养。饲养细胞是一类不能连续分裂的细胞，或者说是一类不能长期存活的细胞，一般存活不超过1-2周。
在小鼠杂交瘤细胞做克隆化培养时，通常建议使用健康小鼠的腹腔细胞做饲养细胞，使用时，调整饲养细胞在培养体系中的密度为2-4×104个／ml。另外，也有使用小鼠肾细胞做饲养细胞的例子。

2.琼脂中的克隆化培养

在铺有底层琼脂的培养孔中进行，由于琼脂凝胶的稳定性使得子代细胞不容易脱落细胞集落。温度高时琼脂呈液态，37℃时成凝胶状态。目标细胞事先短暂地悬浮在55℃的液态琼脂溶液中进行快速铺板操作，待琼脂凝固后进行培养，形成散在的独立克隆，方便分离克隆。如果琼脂形成凝胶的温度比较低，可以经过4℃形成凝胶后再进行培养。

建议使用培养皿、6孔细胞培养板做此类克隆化培养。培养皿或6孔细胞培养板无需经TC处理。

根据生长速度、细胞形态、集落形态等特征选择所需的克隆。事先标注克隆的相对位置，挑选时可以使用长丝滴管或微量移液器吸嘴直接吸取，为避免受到周边其他克隆的干扰，建议先去除多数培养液后再吸取克隆。