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基因工程细胞株的建立

发布时间:2015-11-26 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1729

基因工程细胞株是指将携带目标外源基因的重组子,重组到靶细胞基因组内,形成遗传稳定的新基因组细胞,并且重组细胞株可正常表达目标外源基因,这类细胞称重组细胞株,或基因工程细胞株,也称重组体。重组子是指携带外源基因的载体,在真核细胞如动物细胞的基因重组操作中,体外构建的重组子就是由病毒载体和外源基因重组形成的基因表达构架。哺乳动物细扇组操作中,理想的重组子是由腺病毒构建的。

构建基因工程细胞株的过程中,将重组子构建到靶细胞内的操作就称转化。转化方法可分为物理、化学和生物等3种方法。

(一)物理方法转化

1.显微注射

显微注射法是指通过万能倒置显微镜的显微注射针的注射把外源基因导入靶细胞并获得靶细胞转化的技术。此法可控制重组子的注射量,但由于该法每次只能对一个细胞进行操作,且要求有相当熟练技术,不然很难获得稳定表达的细胞克隆。

适用于植物原生质体和动物细胞。

2.基因枪注入

基因枪法是利用高速运动的金属微粒将附着于表面的重组子引入到受体细胞中的一种转化方法。在此过程中,携带有目的基因的重组子首先黏附在徽弹(钨粉、金粉等)表面,通常以氯化钙亚精胺作为沉淀剂来促进重组子DNA与微弹表面结合.结合有DNA分子的微弹经加速而获足够的动量,进而穿透植物细胞壁进入靶细胞。

适用于所有种类细胞悬液和细胞培养物、动植物组织细胞、人体组织细胞。

3,电脉冲穿孔

电脉冲穿孔也称电激法,是利用高压电脉冲作用,使原生质膜的结构改变并形成可逆性的开闭通道,从而使原生质体或动物细胞易吸收重组子;从而实现基因重组到靶细胞的目的。电激法的优点是操作简便,特别是适用于瞬间表达研究,缺点是体外培养原生质体或动物细胞,预先准备单细胞悬浮液较为麻烦,加上电击易造成细胞损伤,其再生率降低。

适用于单细胞悬液(含动物细胞、原生质体)或动物细胞培养物。

(二)化学方法转化

化学法的重现性比较差,但成本低廉,有时也能获得较高的转化率。

例如,利用冰水浴CaCl2低渗处理微生物细胞悬液,使细胞膨胀成球形,此时称感受态细胞;然后经42℃短时处理,使加入到细胞悬液中的重组子进入微生物细胞。

对于动植物细胞,常见的方法有Ca,(P04):共沉淀、脂质体导人、DEAE-Dextran(多聚阴离子)转染等方法。

(三)生物法转染

原核微生物细胞如细菌、放线菌等细胞,是利用质粒载体、噬菌体载体、载粒载体所携带的外源基因的重组子直接进入靶细胞,实现外源基因与靶细胞的重组与表达。操作对象是原核细胞的细胞悬液或液体培养物。

真核细胞,如酵母、霉菌、植物、动物和人体细胞或原生质体,被病毒载体构建的重组子感染而实现靶细胞基因组与外源基因的重组、外源基因在靶细胞内的表达。

操作对象是原生质体或动物细胞悬液,也可使用这些细胞的液体培养物进行操作。

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