一、概况

（一）病毒疫苗

病毒疫苗是生物制品的一个类别，是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物技术进行制备，可以是完整病毒、具有免疫原性的病毒成分蛋白或特定病毒抗原基因的重组表达产物。

病毒疫苗的主要类型有：

(1)灭活疫苗这些病毒疫苗是指构成疫苗的病毒已经处理，丧失了致病力。常用甲醛作为灭活剂，灭活病毒核酸而保留病毒疫苗的免疫原性。如流行性乙脑灭活疫苗、甲肝灭活疫苗、狂犬病疫苗、流感全病毒灭活疫苗等。

(2)减毒活疫苗一种方法是采用自然或人工方法，通过动物传代筛选对人毒性低的变异株病毒，经过病毒增殖，制备的疫苗。减毒活疫苗包括口服脊做灰质炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、乙脑活疫苗、水痘疫苗等。另一种方法是制备基因缺失的减毒活疫苗，即使用去除致病力（毒力）相关基因的病毒株制备的疫苗，如狂犬病毒的脚普激酶缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代）。

(3)亚单位疫苗又分为裂解疫苗和重组疫苗两类。

裂解疫苗是指用化学裂解剂裂解病毒，提取病毒包膜蛋白或衣壳蛋白，除去核酸成分，然后制备的疫苗。如流感病毒裂解疫苗。

重组疫苗是指将病毒抗原基因重组到CHO细胞中，构建特定的细胞株，通过细胞大量培养再收集该基因产物用于疫苗制备的情况。如重组乙型肝炎疫苗（CHO)。
在非动物细胞也有重组疫苗相关细胞株，如将病毒抗原基因重组到酵母中，则有重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）和重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）等对应的生物制品。

(4）双价疫苗及多价疫苗由单一型（或群）抗原成分组成的疫苗通称单价疫苗。由两个或两个以上同一种但不同型（或群）抗原合并组成的含有双价或多价抗原成分的一种疫苗，则分别称为双价疫苗或多价疫苗。如双价肾综合征出血热灭活疫苗等。

（二）疫苗生产用细胞

病毒疫苗制备过程中的细胞类别：

(1)原代细胞培养物直接由组织制备的细胞培养物。

(2)传代细胞系指在体外能无限繁殖的细胞群，但不具有来源组织的细胞核型特征和贴壁细胞依赖性。

(3)细胞系指来自于传代培养的第一次培养或其中任何阶段培养制备的细胞群（非原始培养细胞）。该细胞群通常是非均质的，克隆化培养后可筛选建立相应的细胞株。

(4)细胞库是通过培养细胞用于生产连续多批制品的细胞保藏系统，这些细胞来源于经充分鉴定并证明无外源因子的一个原始细胞库（PCB）和一个主细胞库（MCB)，这些细胞库通常使用超低温冰箱或液氮罐保藏种子细胞，一般实验室使用50L的液氮罐，再配置1-2个10L的运输罐（图12-1)。从主细胞库中取一定数量容器的细胞制备工作细胞库(WCB)。在有限传代系统中，应对超过常规生产所达到的某一个传代水平或群体倍增的细胞进行验证。

(5)原始细胞库由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于安瓶或冻存管，于液氮或-130℃以下冻存，即为原始细胞库，供主细胞库建立使用。由本细胞库移出的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。

(6)主细胞库取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。本细胞库移出的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。

(7)工作细胞库工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓶或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用，即为工作细胞库。每个生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时，细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产限制最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格后，方可用于生产。由本细胞库移出的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。

病毒疫苗生产中需要预先准备大量的动物细胞，然后接种疫苗生产用的标准毒种，适当培养若干时间后，收获细胞培养物，分离纯化后的病毒便是病毒疫苗生产使用的直接或间接原料。

（三）原液制备过程中的大量细胞培养技术

原液是指在病毒疫苗制备过程中，用于制造最终配制物疫苗或疫苗半成品的均一物质。对于多价疫苗制品，其原液是由单价原液配制而成。同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后合并为一批原液。

单次收获物是在单一轮生产或一个连续生产时段中，用同一病毒株接种于基质（一组动物或一组鸡胚或细胞）并一起培养和收获的一定量病毒液。同一细胞批制备的病毒液经检定合格后合并为单次病毒收获液。

在病毒疫苗制备过程中，半成品则指由一批原液经稀释、配制成均一的中间制品。

原液或半成品均需检查外源因子。此外，外源因子特指存在于接种物、细胞基质及（或）生产制品所用的原材料及制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和外源性病毒。

①病毒敏感细胞株复苏→种子细胞扩大培养→细胞罐培养→病毒毒种接种培养→病毒液收获→病毒分离与纯化→疫苗制备与分装。

②原代细胞分离制备→细胞扩大培养→病毒毒种接种培养→病毒液收获→病毒分离与纯化→疫苗制备与分装。

③鸡胚孵化→病毒毒种接种培养→无菌收集尿囊液→病毒分离与纯化→疫苗制备与分装。所用的鸡胚应来源于SPF（无特定病原微生物感染）鸡群，即在封闭式房舍内饲养的健康鸡群，并选用9-11d龄的无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。

二、种子细胞复苏及其大量培养

种子细胞的数量由生产细胞罐的培养体系和种子细胞的接种密度决定，即种子细胞总量＝生产罐的培养体积×细胞接种密度。

因此，从工作细胞库（WCB）中复苏细胞株后，首先接种至6孔细胞培养板或25cm2方瓶进行培养，待生长接近或达到细胞密度极限时，收集6孔细胞培养板或25cm2方瓶内细胞接种到75cm2方瓶继续扩大培养，继续扩大培养时可以同时接种多个方瓶，或者根据需要使用种子细胞罐继续进行种子细胞的扩大培养。

生产水平的生物反应器包括细胞罐、滚瓶、细胞工厂等培养形式。如前文所述，生产用细胞罐的培养体系有300-3000L供选择。

三、鸡胚孵化

产自SPF鸡群的鸡胚蛋在孵蛋器内常规孵化9-11d后，经检查属于正常发育的鸡胚，无菌操作接种毒种于鸡胚尿囊腔内，继续孵化若干天，才能收获尿囊液，分离纯化病毒制备疫苗原液。

鸡胚孵化过程也是细胞扩大培养，属于体内扩大培养。鸡胚孵化时间不足或孵化时间过长，对于病毒接种时机而言都不合理，需要谨慎对待。一般在孵化5d后进行照蛋检查，剔除非受精蛋。

另外还需特别注意的是，非SPF鸡群的鸡胚蛋容易引入各种外源因子，导致疫苗原液不合格，因此，严格控制鸡胚蛋的来源是非常重要的。

四、原代细胞大最培养

原代细胞的来源动物要求健康、无微生物感染，来源动物的日龄也有要求，如狂犬疫苗原液生产过程中是选用12-14日龄的地鼠肾。

制备原代细胞的器官或组织，如沙鼠肾、地鼠肾，在采集过程中要求严格无菌操作，经胰蛋白酶等处理成单细胞悬浮液，选用适宜的培养液，再接种到合适的培养容器中进行扩大培养。当细胞培养成致密单层后，再接种毒种并继续培养若干时间，最后才能收获病毒疫苗原液。