1 范围

本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。

本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酚的测定。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理

测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，加入己烯雌酚标准或样品溶液、己烯雌酚酶标记物、己烯雌酚抗体后，己烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗体的结合位点。结合的己烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测，吸收光强度与样品中的己烯雌酚浓度成反比，按校正曲线定量。

4 试剂和材料

本标准所用试剂除标明外，其他均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB/T 6682 一级水标准。

4.1 叔丁基甲基醚：色谱纯。

4.2 石油醚。

4.3 二氯甲烷。

4.4 甲醇：色谱纯。

4.5 氢氧化钠：1mol/L。

4.6 磷酸：6mol/L。

4.7 20%甲醇的20mmol/L三羟基甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH8.5)，40%、70%、80%的甲醇溶液，此溶液现用现配。

4.8 67mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)：9.61g磷酸氢二钠，1.79g磷酸二氢钠溶解于蒸馏水，定容至1000mL，此溶液现用现配。

4.9 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒，参见附录A。

5 仪器与设备

5.1 酶标仪：波长450nm。

5.2 离心机：转速4000r/min。

5.3 氮吹仪。

5.4 电热恒温水浴锅。

5.5 高速匀浆机。

5.6 C18固相提取柱：长6.5cm，内径0.7cm。

5.7 固相萃取器。

5.8 微型涡漩混合仪。

5.9 振荡器。

5.10 微量加样器：20μL、50μL、100μL、250μL，1000μL。

5.11 微量多通道加样器：50μL、100μL。

6 样品处理

6.1 试样提取

取岀鱼、虾、蟹、鳖等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cmX0.5cmX0.5cm的小块后混匀，置冰箱中冷冻备用。

将样品解冻，取5g（精确至0.01g）样品于匀浆机的玻璃管中，加10mL 67mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2），充分匀浆，称取3g（精确至0.01g）匀浆组织于20mL玻璃离心管中，加入8mL叔丁基甲基醚，强烈振荡20min，4000r/min离心10min，转移出上清液至20mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将2次提取的醚相合并，70°C水浴蒸发至干。

取70%的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，涡旋混合1min，4000r/min离心1min，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解，加1mol/L氢氧化钠溶液3mL，涡旋振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液，加入6mol/L磷酸300μL中和提取液，用C18固相提取柱进一步纯化。

6.2 样品纯化

将C18固相提取柱垂直固定，用3mL无水甲醇洗涤柱子，再用2mL 20%甲醇的20mmol/LTris缓冲液（pH8.5）平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000μL微量加样器全部加入柱中，过柱，然后用2mL20%甲醇的20mmol/LTris缓冲液（pH8.5）洗涤柱子，接着用3mL40%的甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2min以干燥柱子。

用2mL80%的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为1滴/s左右，可用固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加入2mL水，取20μL进行酶联免疫测定。

 

文章来源：《水产品兽药残留限量及监测方法查询手册》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。