（一）电穿孔转染法

【原理】

利用脉冲电场将DNA导入培养细胞的方法称为电穿孔法（electroporation )。应用该法曾将DNA导入多种动物细胞和植物细胞，最近用于细菌的电穿孔法也见报道。电穿孔是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，导致不同细胞之间的细胞膜发生融合作用的过程。电穿孔也可以促使细胞吸收外界环境中的DNA分子，在微孔开启期间，细胞外界环境中的DNA分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。由于这项技术不依赖细胞的特性，所以可用于几乎所有类型的细胞，对于磷酸钙DNA共沉淀法等其他技术不能奏效的细胞系，电穿孔法仍可适用。电穿孔的优点在于：①通过电穿孔转染基因的拷贝数一般是1～20左右，而不像磷酸钙转染那样基因是一大串连的排列，这样低的基因数对于研究基因的调控表达是很有用的；②通过电穿孔转染DNA进入核内及整合的发生没有末端的重排和修饰；③除质粒DNA外，大的基因组DNA(>65kb)也可用此方法进行转染；④它既可产生高频率的稳定转染，又可产生瞬时的基因表达。但要决定所研究的特定细胞系的最佳转染条件则必须进行大量工作，因此有必要进行一系列预实验。

【材料】

1. DMEM完全培养液，胰蛋白酶，电穿孔杯，电脉冲仪。

2．电穿孔缓冲液：有3种缓冲液可供选用

(1) Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco PBS，不含Ca²⁺和Mg²⁺)

(2）磷酸缓冲蔗糖溶液（272mmol/L蔗糖，7mmol/L K₂HP0₄ pH 7.4 ,1 mmol/L MgC1₂ )

(3) Hamm's F12培养基（不含小牛血清或抗生素）

【方法】

1．转染前24～48小时传代，在完全培养液中培养待转染细胞，细胞生长至50％～75%满底时进行转染。贴壁细胞要用胰蛋白酶消化，分散后制备细胞悬液，在4℃下，800r/min离心5分钟，收集细胞。

2．用预冷的电穿孔缓冲液冲洗两次（4℃,800r/min离心5分钟），然后将细胞重新悬浮在该缓冲液中，使细胞的终浓度为（0.5～1.0)x10⁷个细胞／ml，或用更高浓度的细胞（高达8x10⁷个细胞／ml)，视具体细胞而定，通过预试验确定。

3．取0.8ml细胞悬液放入0.4cm的电穿孔杯中，取2.5～40ug线性化的DNA加入细胞悬液中，充分混合，冰浴中放置10分钟。

4．将电穿孔杯放在电脉冲仪的正负极之间，电击一次。电击条件为：

(1）在Dulbecco PBS中进行电穿孔：电容为25 uF，电压为100～1600V(250～4000V/cm)；

(2)在磷酸缓冲蔗糖溶液中进行电穿孔：电容为25 uF，电压为100～1000V(250～2500 V/cm )；

(3）在Hamm's F12培养基中进行电穿孔：电容为960uF，电压为250～450V(625～1125V/cm)。

5．电击后将电穿孔杯放入冰浴中10分钟。

6．用非选择性完全培养基20倍稀释被转染细胞，并用该培养液洗电穿孔杯，以移出所有的被转染细胞。置37℃,5% C0₂培养箱中培养。以下操作过程同本节二、（二）中第2项，利用BES缓冲溶液系统的磷酸钙转染法的（6)和（7）所示。

【注意事项】

1．电击的最大电压和电击持续时间是影响转染效率的两个主要因素。电压太低和（或）持续时间太短，培养细胞质膜的改变尚不足以允许DNA分子通过；电压太高和（或）持续时间太长，细胞将受到不可逆的损害，电击后细胞不能存活。细胞存活的百分率可以用锥虫蓝拒染法得以检出。所以一定要反复试验找出最佳电压及持续时间。

2．细胞类型、生长速率及生长期均影响电转的效率。生长快的细胞比生长慢的细胞转化效率高。细胞处于有丝分裂期时更易感受外源DNA。

3．电转缓冲液对细胞的影响

(1)缓冲液的电阻影响电击时间。

(2）渗透压影响细胞的脆性。

(3）缓冲液的成分，如二价阴离子，影响细胞膜的稳定性。

(4）缓冲液中的某些成分能进入可透性细胞，对细胞产生不良影响。

4. DNA的状态也影响电转效率，虽然无论是线状或环状DNA都可通过电穿孔法得以转染，但采用线状DNA，无论瞬时表达还是稳定转化，其转染水平都要高一些。所以要使外源DNA整合到细胞染色体中，最好用线性化DNA，因为线性化DNA有较高的重组几率；瞬时表达时用环状DNA即可。DNA浓度在2～40 ug/ml范围内时，当DNA的浓度增加，转化效率也增加。作稳定表达时，DNA浓度为2～10ug/ml即可，而某些瞬时表达系统则需20～40 ug/ml。介导DNA（如鲑鱼精液DNA）的使用，也能增加转化效率。

5.温度一般来说，在电击前及电击后将细胞置冰浴10分钟是必需的。但也有报道某些类型细胞在室温下也可获得较高的转化率。这些互相矛盾的结果可能是由于不同型别的哺乳动物细胞对所通连的电流的反应不同，或者由于电压较高（>1000V/cm）和（或）电脉冲时间较长（>100毫秒）时它们在电穿孔过程中所产生的热量有所不同。