显微注射（microinjection）技术系采用显微注射仪将微量生物分子注射入细胞内的一种技术。该技术最常应用于卵细胞，特别是受精卵和胚胎细胞的大分子（DNA, RNA和蛋白质）的微量注射。

卵细胞的显微注射开始是在两栖类、鱼类等体积大的卵细胞中进行，随着显微注射仪性能以及操作技术的不断改进，逐渐发展到在哺乳类和人类的卵细胞中操作。到目前为止这一技术已广泛应用于动物受精、胚胎发育及大规模改造生物遗传形状和开发生物药物的研究之中。应用受精卵的基因注射技术，已成功地研制出转基因鼠、兔、牛、羊、猪以及鸡等转基因动物，显微注射技术作为研制转基因动物的主要技术已日臻成熟。但是由于我们对生物基因组的结构和基因表达、调控的机制等基础理论研究相对滞后。经显微注射的外源基因进入细胞核后，其与宿主染色体的整合、调控表达等难于控制，致使产生的转基因动物存在外源基因不能整合，或整合位置影响了宿主基因组的基因表达异常导致的存活率低，先天畸形和外源基因表达不满意等问题。这些问题成为用该方法研制和开发转基因动物的瓶颈。

本节主要以小鼠为例，叙述卵细胞显微注射技术的操作过程。

【材料】

1．试剂

(1）孕马血清促性腺激素（pregnant mare's serum gonadotropin, PMSG）冻干粉剂，用生理盐水溶解至终浓度为501U/ml，分装储存于-20℃冰箱中。

(2）人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG）冻干粉剂，用生理盐水溶解至终浓度为501U/ml，分装储存于-20℃冰箱中。

(3) CZB卵培养液配方见表3-6。

(4) H-CZB卵操作液配制：100m1 CZB中加入0.4776g Hepes和0.042g NaHC0₃及0.01g BSA。

(5）透明质酸酶（hyaluronidase )：用H-CZB配成终浓度为0.1 mg/ml。

(6）液体石蜡。

2．仪器显微注射仪，拉针仪，融针仪；解剖显微镜；C0₂培养箱；硅化的毛细玻璃管（外径lmm)；普通BDH硬玻璃管。

【方法】

1．注射材料的准备

(1)移卵管的制备：首先取BDH玻璃管一只，双手执玻璃管的两端，将管的中部置乙醇喷灯外焰，烧红至变软后迅速离开火焰，同时双手外拉，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细砂轮小心将细管切开，在100倍显微镜下观察切口应平齐（如不平齐，应重新切割）。然后于乙醇灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理（即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意）。理想的移卵管内径应为100～150 um，大于1个卵而小于2个卵，其前段较细部分有2～3cm。将另一端连于一适当长度的硅胶管上，硅胶管末端可接一次性口控管，构成“口控管一硅胶管一移卵管”的操作系统。

(2）注射针的制备：用硅化毛细管拉制注射针，全过程在拉针仪上进行。按照拉针仪说明书附的调试参数，反复调试灯丝温度、拉力强度等参数，以拉制较适用的注射针。用于注射DNA的注射针的尖端口径应小于1um，在显微镜下如可看到开口说明口径太大，易使注射量不易控制，而且每次注射后压力降低，产生回流使DNA稀释。拉制的DNA注射针如当日使用，用前不需要清洗与消毒。如数日后使用，应在使用前消毒，注射针应在消毒环境存放。避免粉尘（如用滑石粉的手套等），以免针头堵塞。

(3）持卵管的制备：持卵管用于注射时固定卵细胞。其制备与注射针基本相同，不同之处在于用拉针仪拉制口径为80～120um,再用融针仪将微管开口处烧成如图形状，其口径约15um（图3-6A)。将持卵管尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置使弯成如图所示角度（图3-6B)。