1.动物的准备

(1)供体母鼠的准备选择供体母鼠，主要指标是母鼠的排卵能力、健康状况以及遗传背景清楚。如制备转基因鼠则选用4～6周母鼠作为超排卵供体；因为3～4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。在超排卵情况下每只母鼠每次产20～30枚卵。如每周作2～3次显微注射，每次用卵供体母鼠10只，可每周1次从动物中心领取20～30只。

(2)与卵供体母鼠交配的正常公鼠公鼠性成熟在第6～8周，不同种系公鼠正常性维持时间不一，一般1～2年，但纯系公鼠只可使用8～10个月，此后公鼠生殖功能下降。每个公鼠需单笼饲养以免咬伤，饲养1～2周后方可与母鼠交配，每个作超排卵的母鼠与1个公鼠交配，次日上午检查母鼠阴栓并做记录，如两次以上都不见使母鼠有阴栓，或总的阴栓产生率低于60％～80%，则需更换公鼠。为保证有足够的受精卵，公鼠最好每周只交配一次。如前所述，每周做2～3次显微注射，每次10只供体母鼠，则需养20～30只正常公鼠。

2．超排卵与受精卵的采集

(1)母鼠的超数排卵

1)取4～6周母鼠在明暗循环（早6时，晚6时）的动物房内饲养3～5天。

2）腹腔注射孕马血清：剂量为51U，腹腔或皮下注射，注射后放原笼饲养。

3) HCG腹腔注射：孕马血清注射后46～48小时后进行，剂量为51U(0.1ml)，腹腔注射。

(2）取卵：选带阴栓母鼠置于饲养宠上，拉颈处死。以70％乙醇喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬。将鼠面向上平放于吸水纸上，用消毒剪刀在下腹部中间剪开1个小口。一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部。剪开腹膜，将内脏翻向上，即暴露两侧卵巢与输卵管（图3-7)。用细镊子夹住子宫与输卵管连接处，先剪断卵巢与输卵管连接处，再剪断子宫与输卵管连接处，即得到输卵管（图3-8)。将输卵管转移到盛有H-CZB的培养皿内，室温操作。

将H-CZB操作液以多个液滴滴于35 mm直径的平皿上，液滴内置一输卵管组织，平皿置于解剖显微镜台上，在20或40倍镜下找到输卵管膨大部（壶腹部）（图3-9）。用钟表镊尖撕开壶腹部，待卵逸出或用钟表镊轻轻拔出，此时可见卵细胞周围包被多个颗粒细胞。再用烧尖移卵管（口径0.2mm）将卵吸入透明质酸酶溶液液滴内，轻轻吹吸以助消化，待卵由聚集状态分散成单个细胞后，随即将其转入大滴H-CZB内，用H-CZB洗3～5次后，将卵转入37℃,5% C02孵箱中含CZB培养液的培养皿内。取卵一般在上午进行，全过程应尽快完成(1小时内）以减少暴露状态给卵带来的不利因素。

3．显微注射倒置显微镜可配用培替培养皿（Petri dish)作注射槽，滴1大滴CZB培养液在培养皿中心，上面覆盖矿物油。液滴尽可能平滑以免增加曲面折射从而干扰操作。

(1)将注射槽置于显微镜台上，用低倍目镜聚焦在液滴底部。将持卵管从左侧插入液滴并调节使其与水平面成100～150的角（图3-10)。

(2）转移数个卵至注射槽，一般置于中线上部，用高倍镜检查以确定其原核可见。如看到原核，将镜头转向低倍。

(3)将注射针钝端插入DNA溶液，溶液将靠虹吸作用充满注射针头部。一般充盈部位距尖端数毫米大致与颈平齐，此时溶液约0.5ul。将注射针与注射器或注射压力泵接通，并连在右侧操作臂上。将注射针插入槽上的液滴内，注射针与平面约成50～100的角（图3-10)。

(4）检查注射针是否堵塞。在高倍镜下将注射针在同一水平上靠近1个卵，用力推注射器或启动压力泵，这样DNA液流将能使卵移动。如不能则需换一根针并重复以上操作，直至找到一根合适的。

(5)移动持卵管使其靠近1个卵，增加负压使吸住卵。聚焦以显示原核。如原核位于注射针一侧，并靠近持卵管的中心轴，则较容易注射。如核远离中心轴注射时卵将旋转。必要时调节卵与持卵管的相对位置，可将卵吹离，略施压力使其轻微旋转，在旋转至合适位置时再吸住。当相对位置合适后，适当旋转注射器使负压略增以吸住卵。此时可见透明带被轻度吸向持卵管的开口部，但卵本身形状不变。雌雄原核均可注射，雄性原核通常较大且靠近细胞表面而较易注射。

(6）重新对原核聚焦，将注射针靠近卵，用右侧显微操作仪上垂直控制旋钮调节注射针使其与卵在同一水平面上。如注射针连注射器，注射前需先推活塞以吹出回流的培养液，用压力泵则不需这一过程。将注射针通过透明带指向原核，此时持卵管、注射针与卵均聚焦清晰（图3-11)。如卵移动或原核聚焦不清，则不宜注射。继续向前推注射针使其进入原核，注意因核仁特别黏，注射针勿触及核仁以免黏着。当注射针进入原核后，推注射器活塞或踩压力泵，如原核明显胀大，说明注射成功。这时迅速拔出注射针，如拔针太慢，常触及核内有形成分（核膜或染色体），可将核内容物一同拔出。

(7）如卵保持完整，将镜头转至低倍。将已注射的卵移至液滴中线下部，再吸1个卵注射。同一注射针可连续反复使用。平均每根注射针可注射5～10个卵。当注射槽的卵完全注射后，将它们转入另一只含CZB培养液的培养皿中，置37℃,5％二氧化碳孵箱。再转移一些未注射的卵到注射槽上。每次移到注射槽上的卵可供半小时至1小时注射。如卵于室温置H-CZB操作液中时间太长则对其有害。

【结果】

1．受精卵健康状况的分析健康的卵在解剖镜下可见清晰轮廓，且在透明带与卵之间有卵周隙。溶解的卵将充满全部透明带。一般50％～80％的卵在注射后仍保持健康。

2．原核的辨认对于显微注射而言，原核的辨认显得十分重要，否则微注射后的转基因效率极低。一般小鼠的原核非常容易辨认，在高倍镜下小鼠受精卵一侧可见第二极体，胞质中央清晰可见雌、雄原核。原则上，一般注射雄原核。雌原核、细胞质、二细胞期胚的细胞核或囊胚腔内也可注射，但基因整合效率极低，嵌合现象严重，故不常采用。所以，要在Hoffman目镜下原核清晰可见。如小鼠未见原核，鼠卵可能未受精（此时无第二极体）；或鼠卵刚刚受精原核尚未形成，此时可将卵移入H-CZB培养液中一段时间随时镜下观察直至看到原核为止；或受精卵原核已裂解，卵将分裂成两细胞。

3．微注射成功的判断

(1)受精卵前核膨大、核膜清晰，说明注射成功。

(2)核变形、核仁流出，则可能是因为注入过多的DNA样品而导致了核破裂。

(3）退出注射针后，核质或胞质随针流出或被拉出，说明受精卵破裂。

(4）注射后受精卵成活的分析：体外培养过夜后发育成两细胞的卵为成活的受精卵。

4．成活卵细胞在H-CZB培养液中第二天发育为两细胞期；第三天发育为四细胞期；随后5,6个小时发育为八细胞期；第四天形成桑葚胚。说明这些卵已经具有了分化功能。

【注意事项】

1．卵的健康与筛选凹玻片或培迪培养皿的中央处滴一滴约50ul的CZB培养液，液体石蜡覆盖后，用吸卵管移入H-CZB洗涤后或在培养液中培养的受精卵。在显微镜50～100倍的视野内用移卵管把受精卵移至视野的一侧，再于200倍的视野下对受精卵予以筛选。合格的受精卵应具有下列特征：①细胞饱满、透明带界面清晰（但由于受精卵代谢旺盛，有些卵的形态可能不规则）；②原核清晰可见。将选出的受精卵先置于视野的另一侧，筛选完毕后，移入注射槽。其余的受精卵可继续培养，待第一次注射完成后，再筛选、注射。

2．注射操作时的注意事项、是否成功

(1)显微注射中遇到的一个固有问题是振动。振动可引起靶细胞和注射针的非控制性机械移位，导致针刺入细胞、注射针退出的困难。因此，尽可能地使操作仪与环境振动相隔离。将电机、操作控制器。照相控制器和其他附属装置（与振动有关的）移出显微操作台。电线及管线安装应悬离于桌面，防止振动桌面。最有效的控制振动方式：采用防震桌和防震台。
另外，在整个过程中，注射针尖应远离工作人员和实验室中附近的仪器，这一点必须保证。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可把注射针“射出”。

(2）注射时受精卵的位置很重要。持卵管尽可能持住受精卵有极体的一侧，雄前核应尽可能位于持卵管中线并靠近受精卵的表面，保证注射针尖刺入细胞膜，既不偏刺，也不扭动刺入，这样既可以增加注射针进入前核的把握，又可以减小对卵的损伤。

(3)注射针的质量是转基因成败的关键之一。理想的注射针首先应该畅通，其次是尖细（尖部开口小于1um)，另外尖部长度适宜（50～80 um )。判断针是否堵塞的方法是先将针刺入前核中，然后用注射器长时间加压注射，如果此时前核膨大，甚至破裂，说明针尖开口良好。否则，则可能被堵塞或拉针时被封闭。此时可将针尖部轻触持卵管以折断堵塞部分使其通畅，但有时折断后针尖太粗，必须重新换针注射。有下列情况之一者需更换注射针。①尽管原核清晰可见但注射针不能刺入原核；②连续两个卵在注射后立即溶解；③注射针尖部明显不干净或核内容物黏着在注射针上；④注射针尖已断可看到开口（直径大于1um);⑤注射针已堵塞。

(4)由于鼠受精卵透明带、细胞膜及核膜的韧性大，显微注射时应将注射针快速刺入（退出）前核，刺入前核的注射针不得触及核仁，以免核仁黏附、堵塞注射针或随注射针被拖出而损伤受精卵。另外，在注射前，操作者应先将注射针在卵外对前核做试探性瞄准，然后一次准确刺入前核中，尽可能减少和避免因注射针在卵内移动而损伤受精卵。

(5）注射时，有时会发现针尖有液泡冒出，这是因为针尖太粗尚未刺破细胞膜或核膜的缘故。此时应快速刺入或将针刺过核的另一侧，以期针尖穿过核膜细胞膜或考虑更换注射针。但也要注意，由于核质极黏，有时虽然穿过了核的另一侧，由于该侧粘住针尖不易脱落，也难以真正将针置于核内。在某些情况下，注射针在细胞膜造成一个小缺口，然后快速有限度地刺入细胞中。这种操作是通过快速敲击显微镜的底座来达到。通过敲击造成针尖小幅度的移位，通常足以使注射针穿过细胞膜。

(6)注射量和速度。注射的基因量一般为0.5 u1。有时估计出注射量是很重要的，注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射的效果最好。

(7）注射后，受精卵原核膨大、核膜清晰，如果未出现这些情况说明DNA未注入核内；如果核变形、核仁流出则可能是因为注入过多的DNA样品而导致了核破裂。如果退出注射针后，核质或胞质随针流出或被拉出，说明受精卵破裂。这些受精卵在移植时应弃掉。

(8）大分子DNA以及酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）的显微注射稍有不同，主要是因为大分子DNA通过针尖时受机械剪切作用可能会导致DNA链断裂。另外，我们还发现，即使DNA (650kb )样品浓度很稀（如1ug/ml）时，黏液的黏度仍然很大，常规的注射针极易被堵塞，此时可将注射针轻触持卵管，使针尖微折断、开口变大，注射则容易进行。但开口不能过大，否则卵存活率极低。