乳腺上皮细胞在脂肪组织中呈树枝状增殖，于妊娠末期几乎全部埋在脂肪组织中，分娩时细胞受到诱导而迅速分化，产生大量乳汁，已悉这一系列变化均在激素等的调节控制之下。当研究化学致癌物、致癌病毒对乳腺上皮细胞的致癌作用时，此细胞较易观察到其增殖，分化和转化等现象，因此欲详尽了解这些重要因素时，乳腺上皮细胞的模型培养是较好的材料。

本实验介绍小鼠乳腺上皮细胞的分离培养法，也可取材于人乳腺切除组织或乳腺成形术的组织，使用无血清培养基MCDB202或MCDB170，再加上皮细胞生长因子，胰岛素，氢化可的松，猪催乳素，牛垂体浸出液，前列腺素E等，MCDB培养基也可用Eagle或RPMl 1640等加小牛血清代替，培养方法可参考本试验。

【材料】

1．组织来源雌性小鼠5只（用10～12周龄处女小鼠，最好是中期妊娠的乳腺，细胞收获量大）。

2．试剂

(1)消化液：0.05％胶原酶50m1 (I型胶原酶-Sigma, 300U/mg，按0.5％比例溶于Hanks液中，滤过除菌，冻存，使用前用Hanks液作10倍稀释）；0.05％蛋白酶50m1（蛋白酶E70 000～100 000U/g，溶于Hanks液中，滤过除菌。此酶需用时现配）；0.1% DNA酶〔Sigma DNase 1型，（DN-25 )溶于PBS中，滤过除菌，冻存〕。

(2）其他：Hanks液，胎牛血清（FBS),5％牛血清清蛋白（BSA)/Hanks液或DME培养基（Dulbecc。改良的Eagle培养基），0.1％结晶紫／0.1mol/L枸橼酸。

3．培养基

（1）血清培养基：DME或F12+10% FBS；

(2）无血清培养基：DME:F12=1:1，加胰岛素1～5ug/ml，转铁球蛋白（transferrin)l0ug/ml，牛血清清蛋白（BSA)1～5 mg/ml等；

(3)胶原凝胶铺底液：酸性胶原液（商品或自制鼠尾腱胶原），10×Fl2，用缓冲液稀释。

4．器具10ml或50ml离心管，10cm塑料培养皿，300ml有盖的三角烧瓶2个（处理胶原酶及蛋白酶用），高压灭菌的带尼龙网（孔径150um）的烧杯，手术刀、止血钳等解剖用具，细胞计数器一套，恒温振荡器等。

【方法】

1．小鼠麻醉致死，75％乙醇消毒全身后置蜡板上，用大头钉固定四肢，沿正中线剪开皮肤，用镊子引开皮肤用大头针固定在板上，可见切口两侧表皮及皮肤反转的内侧自上而下有五对乳腺（图4-4)，切下左右五对乳腺脂肪组织放入装有Hanks液的平皿内洗涤，移至空的10cm塑料平皿内。

2．用锋利刀片反复切割乳腺，或用剪刀剪碎，然后将组织碎块移至离心管中，补加少许培养液用吸管吹打片刻，静置3～5分钟，此时乳腺细胞团等沉至管底，而脂肪成分或其他含纤维多的碎块易浮于液体上部，除掉上层液可排除非腺细胞等，如此可重复2～3次。

3．乳腺细胞团移至三角烧瓶内，加50ml胶原酶，置37℃恒温水浴中水平振荡1～2小时（100～200次／分钟）。当无大片组织块时，用尼龙网将细胞滤至烧杯内，以除去未消化的组织。滤液移至50ml离心管内800r/min离心3分钟，去上清，加Hanks液2ml在手中振摇使细胞团打散，移入装有胶原酶50ml的三角烧瓶内。这时会见部分细胞悬液中出现云雾状，不必担心，经10～15分钟后会消失，放恒温37℃水浴中缓慢水平振摇30分钟（30r/min )。

4．加10％血清或用无血清培养基时加牛血清清蛋白（BSA)，量约5 ml，同上法用尼龙网过滤，800r/min离心1分钟，向细胞集团中直接加血清或BSA约1 ml，拍击离心管打散细胞团（此时细胞脆弱，一般不进行吹打）。移至l0ml离心管中，加Hanks液5ml混匀，800r/min离心1分钟，洗涤细胞，如此（加血清或BSA、加Hanks液，离心）洗细胞3次，这样可除去成纤维细胞和红细胞（注：此阶段也可出现云雾样现象，可能是从破碎的细胞中析出的DNA,若遇此情况可加DNase 0.1 ml，很快便可消失）。

5．最后向细胞团中加血清或BSA，打散细胞团，加5～10m1 Hanks液吹打10次左右，使其成为均一细胞悬液。计数细胞数（用此法分离的细胞多呈块状，很难正确计数，必要时用0.1 ml细胞悬液加0.9ml结晶紫，剧烈振摇细胞约1分钟，此时细胞易破坏而使胞核着色，可计数蓝染细胞核数）。1只小鼠的乳腺细胞收获量约为（1～2)x10⁷个。

6．得到的细胞用含10% FBS的DME培养基或用无血清培养基悬浮，因乳腺上皮细胞对底物附着甚牢，不利于制成细胞悬液传代，故平皿应先铺以胶原凝胶，接种平皿的细胞浓度为5 x 10⁵/cm²以上。如在胶原凝胶中包埋培养时，可见树枝状增殖。