背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）为感觉神经节，起源于神经嵴，含有两种类型的神经元，分别对神经生长因子（NGF）和脑源生长因子发生反应。从鸡胚背根神经节分离的神经元仅对神经生长因子反应，具有易维持，大小适宜的优点（胞体大小为10～35 um )，可进行低密度培养。实验室利用培养的细胞节细胞可进行轴突生长发育的研究。

神经组织细胞的培养比其他组织细胞的培养要困难，其理由为：①除个别例子外，神经细胞不进行分裂，细胞在平皿中长出的神经纤维作为触突，但细胞数量并不增加，因此若混入了增殖性细胞，其大量增殖的细胞会使好不容易得到的神经细胞被挤掉；②神经细胞在脑中大多为细胞体，伸出的轴索纤维和复杂的树状突起，在制取细胞时易受较大损伤；③神经细胞的生长多需特殊的生长因子或与神经细胞的种类关系密切特殊物质，这些复杂的依存关系较难搞得很准确；④在体外培养条件下神经细胞的鉴定也很困难。

【材料】

1．组织来源鸡胚（12～14日龄）2～3个。

2．培养基DMEM/F12培养基的制备取DMEM/F12 (50: 50) 500m1，补加胎牛血清(FBS) 50ml（相当于10%),200mmol/L L-谷氨酞胺5m1（相当于1 %) ,100mmo1/L丙酮酸钠5m1(相当于1%）等3种溶液，按一次用量分装，-20℃贮存。培养神经元细胞时需加神经生长因子（NGF-β）至终密度为lOng/ml (NGF-β母液为100 ug/ml)，再加占以上所有成分10%的鸡胚浸出液（chick embryo extract, CEE)。

3．培养试剂

（1) L-半胱氨酸母液：L-半胱氨酸5 mg溶于无菌蒸馏水I ml中，-20℃贮存；

(2）消化液：胶原酶母液（胶原酶5 mg溶于l ml无菌蒸馏水中，-20℃贮存）；木瓜蛋白酶母液（木瓜蛋白酶10mg/m1,4℃贮存）；

(3）多聚L-赖氨酸（Poly-L-lysine )氢溴化物（分子量为30 000～70000)，浓度1 mg/ml ,溶于10mmol/L Tris碱（pH 8.0) ,4℃贮存；

(4)层粘连蛋白母液：层粘连蛋白50 ug/ml，用无菌PBS液溶解，4℃贮存；

(5)细胞分裂抑制剂（5-氟-2‘-脱氧尿昔15 ug/ml和尿昔35ug/ml)；

（6）其他：无钙镁Hanks液（CMF-Hanks )。

4．实验器材手术器材如手术刀、钝头剪刀、细镊子、离心管、各种试管、35mm,60mm玻璃和塑料培养皿培养皿、co₂孵箱等、解剖显微镜。

【方法】

1．取材前在15 ml离心管中配制细胞分离酶液：

木瓜蛋白酶母液 0.8ml

胶原酶母液 0.4ml

L-半胱氨酸母液 1.0ml

CMF-PBS6.8ml

在上述总量9.0ml酶溶液中，木瓜蛋白酶终浓度为0.8mg/ml，胶原酶终浓度为0.2mg/ml, L-半胱氨酸终浓度为0.5mg/ml。

2．取材 用70％乙醇擦洗消毒鸡卵外壳，放于蛋架上，令鸡卵气室朝上，用无菌手术剪剪去气室的蛋壳，用弯镊小心拨开尿囊膜，将鸡胚取出并移入无菌的60mm培养皿内。

3．获取神经节杀死鸡胚，用无菌解剖刀、镊子去除鸡胚的腿和翅，腹向上放置培养皿内，用钝头剪刀沿正中线剪开并将皮肤向两侧卷缩，用镊子将鸡胚的肺和其他内脏（消化器、肾等）拉出胸腹腔外，暴露胸、腹、盆腔脊椎骨，边用CMF-Hanks液漂洗体腔，边用细镊子小心去掉脊柱上残留的疏松结缔组织和黏附物质。操作要小心，不能伤及交感链和背根神经节的尾端。在解剖显微镜下用细镊子从脊髓上细心撕下脊膜，去除脊椎骨，露出神经后根束（图4-3)，用镊子抽出神经束，用剪刀从神经干上剪下神经节，用细镊子将神经节放于盛有1 ml CMF-Hanks液的35 mm培养皿内，仔细摘除神经节上的黏附组织并漂洗神经节，神经节取至10个左右（从2～3个鸡胚中取之）。确保剪下的神经节无任何黏附组织和神经干，分离时间以不超过45分钟为宜。

A．受精15日龄鸡胚腹部正中切口，去除腹腔内消化器及肾脏等内脏；

B．为A的圆圈部分放大图示盆腔椎骨旁后根束神经节，箭头示神经节

4．消化神经细胞节在实体显微镜下将神经节周围的结合组织和囊膜等去除，然后用剪刀将每个神经节剪切成2～3个小片，将小片移于离心管中，加入37℃预热的胶原酶-木瓜蛋白酶消化液2～3ml，置37℃水浴箱内温育8分钟（如果鸡胚为13～18日龄时，热消化时间需13分钟），每隔3分钟颠倒一次离心管，并轻轻振摇离心管，到8分钟时加入1 ml胎牛血清以终止酶解反应，消化后用吸管轻轻吹打，使之成为组织悬液。（因神经细胞极易受损，吹打要轻微）。800r/min离心5分钟，沉淀细胞节，去上清液，用CMF-Hanks液清洗细胞节1次，再离心沉淀。

5.分离细胞节细胞细胞节沉淀用1 ml补加NGF-β的完全DMEM/F12培养液，用吹打管轻轻吹散经消化的细胞节（反复6次），如果仍有残留的组织块，使其自然沉淀，将上面的细胞悬液转移至另一支15 ml无菌离心管中，再用吹打吸管继续吹散残留的组织块，收集上方的悬浮细胞，与前次收集的悬浮细胞混合于离心管内。

6．细胞计数与接种细胞悬液从10日龄鸡胚的腰区分离的细胞节，一般含有约7000种神经细胞和35000种其他细胞。经细胞计数，调至细胞浓度为1x10⁶个／ml，接种于含有NGF的完全DMEM/F12培养基的35mm培养皿，置C0₂孵箱中37℃,5% C0₂孵育，观察生长情况。接种第3天，更换新培养液，同时在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2’-脱氧尿昔15ug/ml和尿昔35ug/ml，以抑制非神经细胞的增殖，作用48小时后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液2次，每次更换一半新鲜培养液。

【结果】

鸡胚神经节细胞接种后，4小时大部分细胞可贴壁，呈圆形或椭圆形，直径8～14um，胞体周围呈现一圈光晕。神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧，核仁明显，亦可见双核神经元。接种后24小时大部分贴壁细胞开始长出突起，在体外分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在1天之内可长达数毫米，其中多数背根节神经元为假单极神经元，少数为双极和极少数多极神经元，即神经突起分枝较少，神经元胞体稍小。培养2～3天后神经元的突起逐渐增多并延长，随着培养时间的延长而逐渐增大形成稀疏的神经网络。鸡胚背根节神经元可维持培养2个月。

【注意要点】

1．须在取材前在15 ml离心管中配制细胞消化酶液。

2．为确保剪下的神经节无任何黏附组织和神经干，分离时间以不超过45分钟为宜。