【材料】

1．组织来源犬胰腺组织。

2．培养基F12培养液、加20％小牛血清的F12培养液；加10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、牛血清清蛋白（BSA)。

3．消化液

（1）I型胶原酶：将I型胶原酶溶于Hanks-DVC (pH 7.2～7.4)，浓度1800U/ml，用20倍体积的Hanks-DVC,4℃透析过夜，过滤除菌，分装成10～20ml储存液，于-70℃冻存。

(2) 0.25%胰蛋白酶：将胰蛋白酶(1:250）溶于枸橼酸盐缓冲液中，每升含枸橼酸三钠3g,葡萄糖5g,pH 7.6。

4．其他试剂 Hanks，无钙镁的CMF-Hanks（配制Hanks-DVC )。

5．器具 手术刀、剪、镊，25 ml锥形瓶（经硅化处理），胶原涂布的培养皿，尼龙筛网（孔径20 um,40 um )，透析袋，摇动式培养箱等。

【方法】

1．融化胶原酶液并与等体积的胰蛋白酶混合成细胞消化液，于37℃预热。

2．麻醉动物，手术切取胰腺，放入Hanks液中，去除间质组织膜及其他多余组织，放平皿内，用眼科剪将胰腺剪碎成1～3 mm³的碎片，移入25 ml经硅化处理的锥形瓶内。

3．取5 ml预热的消化酶加入硅化的锥形瓶内，与组织碎块混匀，在摇动的水浴槽内(37℃,120r/min）摇动15分钟，使大块组织沉降，用无菌尼龙筛网（40 um孔径）过滤上清液，该过程重复2～3次，每次都用新鲜的组织消化液，直至胰腺组织块几乎全部被消化分离。

4．用孔径20um的尼龙筛网再次过滤细胞悬液，可用轻微的负压吸引装置帮助滤过顺畅，但压力不可太大。

5．收集过滤的细胞，悬浮于40ml离心管，1500r/min离心5分钟，去上清，将沉淀的细胞重新悬浮于10m1 Hanks-DVC中，取出5 ml细胞悬液轻轻加到另一个盛有35ml 4% BSA的Hanks-VDC的离心管中混匀，800r/min离心5分钟，去除上清，加35 ml含有4% BSA的Hanks-DVC，将细胞再悬浮，此过程重复2次。

6．最后1次离心，去上清液，收集细胞沉淀，加入5～10ml F12培养液中重新悬浮，将细胞移至经硅化的25 ml锥形管中，每管5 ml。通常可获得(1～3)x10⁷个活细胞，其中80%～90％为胰腺细胞。

7．将锥形管置于37℃,5% C0₂的旋转（转速80r/min）培养箱内，空气匀化，旋转培养2～24小时。

8．旋转培养后，待细胞沉降聚集3～5小时，去上清液，用大口径吸管将细胞团块重新悬浮于F12培养液中，计数。根据实验要求，将细胞接种密度定为10²～10⁵个／cm²,24～48小时细胞可贴壁，生长后融合形成集落，然后可连片形成单层细胞。

【结果】

1．培养的胰腺细胞多数为圆形或多边形，有时还可见到导管样结构，其中30％～40%可判断为胰腺细胞，在显微镜下可观察到酶原小滴。

2．通常1g胰腺组织可获得（5～10)x10⁷个细胞，用免疫荧光标记羊抗入胰岛素抗体，可观察到许多荧光反应阳性的胰岛细胞。