体外培养的人来源组织细胞可视为一类在特定条件下生长的细胞群体，它们保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，以及对相应理化和生物因素刺激的应答反应。因此，采用比较容易获得的人来源组织和器官的细胞进行体外培养，对研究人类相关组织器官的生物学性状及相关疾病的发生机制等起到重要的促进作用。常用的人来源组织包括手术切下肿瘤组织和人胚组织等。由于不同组织细胞和器官的结构功能、生长特性不同，在体外培养中分离方法和所需的生长条件也不同。常用的人来源正常细胞培养的条件和方法如下。

第一节人胚细胞的制备与培养

人胚细胞是指来源于人胚胎相应组织的细胞，通常是二倍体细胞，即与原供体细胞的二倍染色体数相同或基本相同（至少75％以上）的细胞群，称为二倍体细胞。二倍体细胞在自然条件下的生命期有限，故属有限细胞系。随组织细胞和供体胎龄的不同，人胚二倍体细胞的寿命长短各异。人胚神经胶质细胞的传代寿命为15～30代，人胚肺成纤维细胞可传50～60代，人胚肾只有8～10代；如从老龄个体取材则细胞生存期更短。为延缓细胞的衰老及保持二倍体细胞的长期应用，一般在初代或2～5代培养后即进行大量冻存作为原种（stookcells )，使用时再进行细胞培养与繁殖，随后再继续冻存保持原种。二倍体细胞的体外培养，可提供大量生物学性状相似的实验对象与材料，被培养的组织和细胞可进行细胞学、免疫学、遗传学、衰老、肿瘤学和实验医学的研究工作。目前实验室常用的人胚细胞是人胚肾细胞和人胚肺细胞（成纤维细胞）等。

一、人胚肾细胞的制备与培养

体外培养的人胚肾细胞常用于研究肾脏疾病的发生、发展机制等。下面介绍的人胚肾细胞的制备与体外培养方法，供体外实验使用。

【材料】

1．组织来源来自自然流产或水囊引产的妊娠10～12周胎儿的肾组织。

2．培养用试剂

（1）清洗液：Hanks液，含有100U/ml青霉素与100ug/ml链霉索。

(2）消化液：0.25％胰蛋白酶。

3.培养基配方和制备DMEM培养液，含20％胎牛血清、100U/ml青霉素与100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科剪、镊子、解剖刀、平皿、100目筛网、恒温电磁搅拌器和培养瓶等。

【方法】

1．取材 用75％乙醇消毒胎儿腰、背部皮肤，无菌条件下迅速取出肾脏放入平皿。剥离被膜、脂肪，去除肾门部组织后，用清洗液洗3次，移入另外一个装有清洗液的平皿内，剪取肾脏浅表的皮质组织，并剪成肉泥状，再用清洗液洗3次，尽量除净血细胞。

2．消化 加0.25％胰蛋白酶，放入37℃恒温电磁搅拌器上消化30分钟，然后进行500r/min低速离心5分钟。

3．分离细胞 弃上清液，加入适量培养液，摇匀，于100目筛网过滤细胞悬液。进行500r/min低速离心5分钟，弃上清液，加入适量培养液，重悬细胞。

4．接种与培养 进行细胞计数后，将细胞以3x10⁶个／ml的密度接种于培养瓶内常规培养，逐日观察细胞的生长情况。一般于培养次日可见细胞贴壁生长，更换培养液，弃去未贴壁的细胞及细胞碎片。以后每隔2～3天更换培养液1次（每次换液50%)。

【结果】

人胚肾细胞呈扁平不规则多角形，细胞中有圆形核，细胞生长时紧密相连呈单层膜（图5-1)。人胚肾细胞一般在4～6天后可长成单层细胞满足使用。肾细胞之间可能混有血细胞，经过几次传代后可以除去。

【注意要点】

1．严格无菌操作。

2．胎儿死亡时间不应超过10小时。药物引产的胎儿不宜使用。

3．最初接种的培养瓶应尽量小些，而接种的细胞数应尽量多些。