成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌，并促进基质矿化形成骨组织。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。目前用于骨组织工程研究的成骨细胞来源主要有两个：骨膜来源的成骨细胞和骨质来源的成骨细胞（如松质骨）。近年也尝试用间充质干细胞作为种子细胞，人骨细胞培养已成为组织工程中的一个重要工具。

（一）骨质来源的成骨细胞的分离和培养

【材料】

1．组织来源关节炎患者骺骨置换的上股骨。

2．培养用试剂

（1）PBS：不含Ca²⁺和Mg²⁺的CMF-PBS液（pH 7.4）。

(2)胰蛋白酶／EDTA液：0.05％胰蛋白酶和0.02% EDTA溶于不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中，PH 7.4。

(3）胶原酶（II型）。

3．培养基配方和制备DMEM培养液，添加10％热灭活的胎牛血清（FCS) ,2mmol/L L-谷氨酰胺、25～50 U/ml青霉素、25～50ug/ml链霉素和50ug/ml新鲜配制的维生素C。

4．实验器材培养瓶或培养皿、咬骨钳、眼科剪、眼科镊、不锈钢解剖刀、细胞滤器和离心管。

【方法】

1．取材从手术或活检取得的骨组织，装入含PBS的容器或不含血清的培养基中，迅速运送至实验室。应用的骨应是无辐射的，最好的骨源是患骨关节炎患者髋骨置换的上股骨。取松质骨1～2g，去除外膜结缔组织，装入灭菌密封容器内，在超净台内用咬骨钳和剪刀将松质骨剪碎成lmm³左右小块。

2．消化把松质骨块置入含有2～3ml PBS的聚丙烯管中，用力旋转摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下。小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，至少重复3次，冲洗至骨片发白。将漂洗过的骨块加入胶原酶，置于37℃水浴箱内1小时，进行1000 r/min离心5～10分钟，弃去消化液。再用培养液洗1～2次，离心（1 OOOr/min离心5分钟）收集细胞。

3．分离细胞加培养液于离心管中分散细胞，上清液经尼龙网过滤后，调成细胞密度为1x10⁶个／ml的悬液。

4．接种与培养将细胞悬液种植于培养瓶中，37℃,95%湿度，5% CO₂细胞培养箱中培养。也可不使用消化酶而进行植块培养法种植培养，将漂洗过的骨块置入培养瓶或培养皿中，每个l00ml平皿或75 ml培养瓶中置0.2～0.6g组织，加入l0ml培养基，培养条件同前。待细胞长满培养瓶壁后进行传代培养。

【结果】

组织块接种后，10小时后开始有梭形贴壁细胞；72小时后细胞全部贴壁，可见细胞呈梭形或鳞片状生长；在5～7天后，可见有细胞从移植块表面增殖出来，多数呈鳞片形，体积较大，胞质丰富，胞核较大，偏于一侧；培养7～10天后细胞从移植物表面移出铺在平皿表面。细胞形态在生长中不断发生变化，开始长出时为成纤维细胞状，以后渐变成铺路石样；一般在接种后4～6周后细胞汇合。电镜观察显示，成骨细胞以长梭形为主，也有多边形、椭圆形和不规则形。胞质内有发达的粗面内质网和高尔基复合体、溶酶体和糖原颗粒等，细胞核大而圆，位于胞体一侧。

【注意事项】

1．取材后要尽量将结缔组织去除干净，以减少成纤维细胞的污染，得到较多的成骨细胞。

2．需掌握好酶的用量和消化时间。

3．避免长期培养，反复传代后容易引起细胞分化和表型的改变。

（二）骨膜来源的成骨细胞的分离和培养

【材料】

1．组织来源手术切除的骨组织。

2．培养用试剂

（1）PBS。

(2) 0.1%EDTA与0.25%胰蛋白酶混合消化液。

(3) l mg/ml I型胶原酶溶液。

3．培养基配方和制备RPMI 1640培养基，配制培养液时加入15％的胎牛血清，添加100U/ml青霉素、100 ug/ml链霉素，用5.6% NaHC0₃调节至pH 7.2。

4．实验器材培养皿或培养瓶、剪刀、过滤器和离心管。

【方法】

1．取材 取手术切除的骨膜，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，去除附着于骨膜上的结缔组织，将骨膜剪碎成1～2 mm2大小的组织块。

2．消化 加入0.1 % EDTA与0.25％胰蛋白酶混合消化液，置于37℃条件下消化20～30分钟，进行1000r/min离心1～2分钟，沉淀骨膜组织块，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤沉淀骨膜组织块2～3次，重复上述离心（1000r/min离心1～2分钟）过程。37℃条件下再用1mg/ml I型胶原酶消化骨膜组织块约90分钟，进行1000r/min离心5～10分钟以沉淀细胞，弃去消化液。

3．分离细胞 用培养液洗涤细胞沉淀1～2次，离心（1000r/min离心10分钟）收集细胞。

4．接种与培养 用培养液制成细胞悬液，细胞密度调成（1～5)x10⁶个／ml。将细胞悬液接种于培养瓶中。待细胞长满培养瓶壁后进行传代培养。

5．传代培养 弃掉培养液。用PBS小心冲洗细胞2～3次。在培养瓶中加入胰蛋白酶/EDTA混合消化液1 ml，晃动培养瓶使消化液与细胞充分作用，弃掉消化液，置37℃细胞培养箱中孵育，随时观察细胞形态。当细胞变圆并已从底物上脱落时，加入含有10% FCS的培养液终止消化作用，进行500r/离心10分钟。弃掉上清液，用培养液轻柔吹打管底细胞，将细胞悬液以5x10³～5x10⁴/cm²数量接种，37℃,95%湿度，5% CO₂细胞培养箱中培养。

【注意事项】

1．用于骨组织工程研究的成骨细胞多来自松质骨、骨髓及骨膜。其中，增殖能力最强的是骨膜来源的细胞，其后依次是皮质骨来源细胞，松质骨来源细胞，骨髓来源细胞。骨形成活动在骨膜来源的细胞中最活跃。

2．松质骨、骨膜来源的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力强，体外培养容易形成钙结节，而骨髓基质干细胞合成碱性磷酸酶能力弱，体外连续培养不容易形成钙结节。