目前，体外培养胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES cell)的方法分为饲养层培养法和无饲养层培养法。饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts, MEF细胞）、已建系的耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系的SIM小鼠成纤维细胞（STO细胞）作为饲养细胞。饲养细胞经丝裂霉素-C或，γ-射线处理、终止分裂后即制备成饲养层（feeder layer)。

由于MEF和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子，在MEF和STO培养上清液中主要存在抑制胚胎干细胞自主分化因子—白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)，所以接种在饲养单层上的胚胎干细胞易于生长。无饲养层培养法则是基础培养基中添加了重组LIF而制备成的条件培养基，同样能保证小鼠胚胎干细胞增殖，并维持未分化二倍体细胞的状态。

第一节饲养层细胞与条件培养基的制备

胚胎干细胞（ES cell)是具有自我更新能力的细胞，具有向机体各种组织细胞分化的潜能，体外培养条件下，为保持ES细胞的未分化状态，通常需将其接种于饲养层细胞，主要有MEF细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）和STO细胞。

一、小鼠胚胎成纤维细胞的培养和制备

MEF细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法，能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性。MEF细胞的分离、培养和生长特征，以及快速、稳定地建立优质滋养层细胞培养体系的方法如下。

【材料】

1．组织来源孕鼠（12.5～15.5日龄），品系不限。

2．培养用试剂

（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。

(2）消化液：0.25％胰酶和0.02 mmol/L EDTA混合消化液。

3．培养基配方和制备MEF生长培养基（高糖DMEM加10% FBS)+l% 200mmol/L谷氨酸盐。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50m1和15m1离心管、手术刀片，以上物品均需经过高压灭菌干燥处理。

【方法】

1．取材孕12.5～15.5天母鼠脱颈断髓处死，70％乙醇消毒腹部，剪开腹壁，充分暴露子宫角，取出整个子宫，置于盛有PBS的平皿内，洗涤3次，去除表面残余血迹。沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤。镊子撕破胎膜，取出胎鼠，去除胎膜，用PBS洗涤3次。去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS洗涤3次，充分去除红细胞。用无菌眼科剪将鼠胚躯干充分剪碎，吸入离心管内。

2．消化加0.25%胰酶和EDTA混合消化液，37℃ 10分钟。取出离心管，反复吹打20～30次，加入含10% FBS的培养液终止消化。

3．分离细胞将细胞悬液过200目的尼龙网。细胞悬液移至无菌离心管中，1000r/min离心5分钟，去上清液，重新将细胞悬浮在含10% FBS的DMEM培养液中。

4．接种与培养细胞计数，以3x106个／ml密度接种于培养瓶中，置37℃,5% C0₂孵育饱和湿度培养箱培养。次日换液，去掉含有胰蛋白酶和较多悬浮细胞的培养液。待细胞达到80％～90％融合时即可1:3～1:6传代，此传代后的细胞记为第一代（P1)。

【结果】

MEF在体外为贴壁生长型细胞，原代培养约12小时开始贴壁，胞质向外伸出突起，形成梭形、多边形或不规则形，细胞核为卵圆形，原代MEF中细胞种类较多，传到第三代时细胞形态较为均一，细胞生长旺盛，很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）单层。第五代以后，可见细胞伪足增多，细胞呈长梭形或条带状，周边向外伸出纤维状伪足并有分叉，细胞内颗粒增多，细胞之间空隙较大。

【注意事项】

1．严格无菌操作。

2．取材时间要尽量缩短，熟练操作。

二、小鼠成纤维细胞系STO饲养层的制备

建立良好的饲养层培养体系对于小鼠ES细胞的体外培养是十分必要的。STO细胞也是常用的饲养层细胞，STO饲养层细胞的制备与胚胎干细胞的形成能力有直接关系，STO饲养层在保持分泌功能的同时失去增殖能力，避免与胚胎干细胞发生生长竞争。STO细胞系做饲养层能够节省实验时间，但价格较为昂贵。最近研究表明，STO饲养层细胞不仅能保持胚胎干细胞的未分化状态，随着共培养时间的延长，还能促进拟胚体的形成。

【材料】

1．组织来源STO细胞系（SLN或STO/N/L细胞株）。

2．培养用试剂

（1）Hanks液。

(2)消化液：0.25%胰酶和0.02% EDTA混合消化液。

(3）丝裂霉素C储存液（0.5～1.Og/L, PBS配制）。

3．培养基配方和制备高糖DMEM培养液含10% FBS。

4．实验器材培养皿、离心管、4孔培养板、吸管、离心机等。

【方法】

1．取材 冻存STO细胞株（5 x 10⁶/ml )复苏后，l ml细胞悬液接种4～5个6cm培养皿。

加含有10% FBS的DMEM培养液，置37℃,5% CO₂孵箱中培养。

2．消化待细胞生长汇合成单层，用新鲜配制的DMEM培养液含有10% FBS和1Oug/ml丝裂霉素C处理2～3小时。如选用γ射线法，当STO细胞生长至汇合成单层时，用14,21,28 GRAY的γ射线照射。处理过的细胞用PBS洗3次。0.25％的胰蛋白酶消化3～5分钟，加适当无血清DMEM培养液吹打，为细胞悬液。

3．分离细胞细胞悬液移至无菌离心管中，1000r/min离心5分钟，去上清液，重新将细胞悬浮在含10% FBS的DMEM培养液中。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以3x10⁶/ml密度接种至4孔培养板上，置37℃,5%C0₂孵箱中培养。

【结果】

STO细胞株经10ug/ml丝裂霉素C处理2～3小时。可有效抑制其分裂，并保持细胞的正常活力；用14 , 21, 28 GRAY的γ射线处理，亦可有效抑制MEF的分裂，保持细胞的正常活力。

【注意事项】

1．由于丝裂霉素C对细胞的毒性作用较强，应控制其作用时间，避免导致STO细胞死亡。

2．注意饲养层细胞的接种密度，如果密度较大，STO细胞会与胚胎干细胞竞争培养基营养成分。