各种免疫细胞是完成免疫应答及其调控的基础。因此，将免疫细胞从混合细胞群体中分离出来对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能特性，以及细胞表面标志等的差异而设计的。细胞的理化性状如细胞的大小、比重、表面电荷和黏附能力等存在差异；而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面蛋白标记来体现，例如免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。

一、外周血单个核细胞悬液的制备

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要指淋巴细胞和单核细胞，PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖一泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation)，用此方法分离PBMC纯度可达95%。

【原理】

PBMC 的密度与血液中的其他成分不同。因此，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集，从而被分离。红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部，淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到PBMC。

【材料】

1．聚蔗糖一泛影葡胺比重为1.077±0.0001;

2．培养液及其他试剂RPMI 1640培养液；pH 7.2 Hanks液（无Ca²⁺,Mg²⁺,CMF-Hanks);2％锥虫蓝染液；肝素用Hanks液稀释成500U/ml;

3．器具刻度离心管、吸管、试管、毛细滴管、血细胞计数板、显微镜、水平离心机等。

【方法】

1．采集静脉血2ml，加入含有肝素的无菌试管中（每1 ml全血用0.1 ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝），混匀，使血液抗凝。用pH 7.2 CMF-Hanks液将抗凝血稀释1倍。

2．吸取淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜450，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。操作中尽量避免吸管碰触管壁。原则上分离液的高度不超过管高的1/4。

3．将离心管放置于水平离心机中，室温下2000r/min离心20分钟。离心后，管内可分为以下四层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；中层为细胞分层液；下层为红细胞及粒细胞；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞，置于新离心管中。尽量少吸取分离液。

4．将所得到的PBMC悬液用5倍体积的RPMI 1640洗涤2次，依次以2000r/min,1500r/min在室温下（18～25℃）离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。

5．末次离心后，弃上清液，加入含有10％小牛血清的RPMI 1640，重悬细胞。

【结果】

取一滴细胞悬液与一滴0.2％锥虫蓝染液混合，5～10分钟后取样高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，一般活性应在95％以上。

【注意事项】

1．应确保淋巴细胞的活性，一般情况下是现采血，马上进行分离。

2．实验器皿必须洁净，如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材、试剂都应为无菌。抽取人外周静脉血时也要注意无菌操作。

3．用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞时，离心机的转速要均匀、平稳。使各层细胞保持清晰的界面。

4．操作应轻柔，不要摇动和打乱液层，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。