一、实验目的

    掌握金标免疫试纸法检测牛奶样品中青霉素残留的原理与方法。

    二、实验原理

   金标免疫试剂法是免疫学方法中的一种，它是抗原抗体特异性反应与色谱技术有机结合的产物。瓷砩剥式纸系一般由样品垫、连接垫、滤膜(结合垫)、吸收垫和垫板等几部分组成。样品垫通常为纸质，附着于连接垫，一样品垫上有加样孔。连接垫上包含有干燥金标(本试纸条上是胶体金标记的抗青霉素抗体和抗二抗金标抗体)的金标垫。滤膜(结合垫)由检测线(T线)和质控线(C线)组成，T线结合有青霉素蛋白质偶联物(如牛血清白蛋白的偶联物)，C线结合有二抗。

    在测试时，将一定量的样品提取液滴入试纸条加样孔内，如果青霉素在样品中浓度低于5ng／mL，胶体金标记的抗青霉素抗体不能与青霉素全部结合，剩余胶体金标记的抗青霉素抗体，通过色谱分离到达固定有青霉素与蛋白质偶联物的测定区(T线)，并与之结合，出现(紫)红色条带。如果青霉素在样品中浓度高于5ng／mI，，胶体金标记的抗青霉素抗体全部与青霉素结合，在测试区(T线)不出现(紫)红色条带。另外，由于抗二抗金标抗体与二抗结合富集，显红色，因此，无论青霉素是否存在于样品中，一条(紫)红色条带都会出现在质控区(C线)内。

    三、仪器与试材    

    1．仪器与器材

    冰箱、烧杯等。

    2．试剂

    青霉素金标试纸条(试剂盒)：附带样品稀释液和滴管等。

    3．实验材料    

    2～3种新鲜牛奶，各50g。

    四、实验步骤    

    1．样品的制备

    取新鲜牛奶放在洁净、干燥的玻璃烧杯内，然后加样品稀释液按1：1稀释，充分摇匀后，待用。

    2．检测

    (1)从冰箱中取出冷藏的试纸条，放置恢复至室温。

    (2)从包装袋中取出试纸条，平放在桌面上(尽量在1h内使用)。

    (3)用滴管吸取待检样品溶液，缓慢而准确地滴加3滴(或以加样管加100μL)于试剂条的加样孔内(注意不要产生气泡)，计时。

    (4)在5～10min内观察结果。

    3．结果判定

    (1)当位置C显示出红色线条，而位置T不显色时，或者当位置C显示出红色线条，位置T显示颜色浅于C时，判为阳性，即样品中青霉素含量超过5ng／mL。

    (2)当位置C显示出红色线条，位置T同时显示出红色线条，且T线颜色接近C线或者深于C线时，判为阴性，即样品中青霉素含量低于5ng／mL。

    (3)当位置C不显示出红色线条，则无论位置T显示出红色线条与否，判为无效。应使用新的试纸卡按说明书要求重新测试。

    五、注意事项

    1．在进行检测前，应认真仔细阅读试剂盒(条)的使用说明书，并按照操作步骤进行测试，操作时勿触摸试纸显示区。

    2．试纸条应保存在干煤阴凉处(4～30℃)，超过有效期请勿使用。

    3．试纸条为一次性产品，请勿重复使用。

    4．试纸条为筛选用试剂，任何阳性结果需用其他方法作进一步确认。

    六、思考题

    1．简述金标抗体的制备过程。

    2．简述制备抗青霉素单克隆抗体的过程。