一、实验目的

    掌握ELISA的工作原理，以及采用ELISA试剂盒检测鸡肉中青霉素残留的方法。

    二、实验原理

    ELISA的种类很多，本实验将介绍一种测定鸡肉中青霉素残留的间接竞争ELISA。在预包被青霉素与蛋白质(如牛血清白蛋白)偶联的抗原(固定抗原)的酶标板微孔内，同时加入样品提取液与抗青霉素抗体，样品中青霉素残留(游离抗原)与微孔内固定抗原竞争抗青霉素抗体的结合位点，洗涤去除为未结合物后，加酶标二抗和底物显色，测定吸光度。吸光度与样品中青霉素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中青霉素残留的含量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材    

    酶标仪、食物调理机、振荡器、离心机、恒温箱、微量移液器等。

    2．试剂

    除特别说明外，实验中所有试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：正己烷、PBST缓冲液(取5.2g Na₂HPO₄·12H₂O、0.88g NaH₂PO₄·2H₂O、9g NaCl、1mL Tween-20，加去离子水1000mL溶解并定容)。

    (2)青霉素酶联免疫试剂盒：包括酶标板、标准品、酶标抗体、抗青霉素抗体、底物液(A

与B)、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。

    3．实验材料

    2～3种冷冻鸡肉，各250g。

    四、实验步骤

    1．溶液的配制

    按照试剂盒说明书的说明，对浓缩洗涤液、浓缩复溶液、酶标抗体、抗青霉素抗体和标准品溶液等进行适当稀释。

    2．样品处理

    (1)取50g冷冻鸡肉解冻，去除脂肪后，切碎，用食物调理机粉碎成均匀糜状。

    (2)取2．00g鸡肉糜于20mL离心管中，加入8mL PBST缓冲液，于振荡器上混合5min。

    (3)加入正己烷5mL，于振荡器上充分混合10min，静置1h。

    (4)以3000g离心15min后，用微量移液器取中间层溶液1mL于10mL离心管中，加入1mL正己烷，于振荡器中充分振荡5min，以3000g离心15min。

    (5)弃去上层，取下层50μL，加入450肛L浓缩复溶液充分混合，取50μL水相进行测定。

    3．检测

    (1)取出需要数量的已包被抗原的ELISA微孔板及框架，将不用的微孔板重新密封，立即重新保存于2~8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做3孔重复。

    (2)将标准品系列稀释液和样品提取液各50弘L加入酶标板微孔中，然后加入抗青霉素抗体工作液50μL，充分混匀后，用盖板膜封板，于37℃恒温箱中反应30min。

    (3)取出酶标板，倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入 250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，重复洗板5次。

    (4)加入100μL酶标记物，用盖板膜封板，于37℃恒温箱中反应30min后，洗板5次。

    (5)每孔加入 A、B底物液各50μL，轻轻振荡混匀，于37℃避光显色15min。

    (6)每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀后，于酶标仪上测定吸光度。

    4．结果判定    

    (1)结果的粗略判定：以样品的平均吸光度与标准系列的平均吸光度比较得出样品中抗生素残留的浓度范围(μg／L)。假设样品1的平均吸光度为0.6，样品2的吸光度为1.0，系列标准液吸光度分别为：0μg／L，1.500；0.5μg／L，1.380；1．5μg／L，1．200；4.5μg／L，0.900；13.5μg／L，0．700；40．5μg／L，0.400。则样品1的浓度范围是13.5～40．5μg／L，样品2的浓度范围是1．5～4．5μg／L。   

    (2)定量方法：将各个浓度标准溶液和样本提取液的平均吸光度(A)除以标准液浓度为0的平均吸光度(A0)再乘以100，即百分吸光度。以青霉素标准品浓度(μg／L)的半对数为横坐标，各浓度标准品的百分吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。从标准曲线中查出样本提取液中青霉素的浓度，乘以对应的稀释倍数即为样本中青霉素的实际浓度。

    五、注意事项

    1．将试剂盒从冷藏环境中取出，将所需试剂从试剂盒中取出，置室温(20～24℃)平衡30min以上，否则可能导致所有标准的吸光度值偏低。

    2．注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

    3．在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好等现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

    4．反应终止液一般为2mol／L的H₂SO₄，避免接触皮肤。

    5．试剂盒应在有效日期内使用，并且不同厂家和不同批号试剂盒中的试剂不能混用。

    6．试剂盒一般需要保存于2～8℃，所以不用的酶标板微孔板重新密封后，应立即放回冷藏环境。

    7．在加入底物液A和B后，一般显色时间为10～15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

    8．通常试剂盒的最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度和灵敏度发生变化。

    9．通常标准物质和发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

    10．发色剂应该无色，显任何颜色都表明发色剂变质，应当弃之。

    11．应严格按照试剂盒说明书，进行实验操作和对各种试剂进行处理。

    12．测定吸光度的波长范围因酶的种类不同而不同，应该根据试剂盒的说明进行选择。

    六、思考题

    1．简述ELISA的种类和原理。

    2．简述ELISA中常用的酶及其反应底物的种类和特性。